全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

進捗 削除/引用 No.530-5 - 2009/05/28 (木) 23:29:22 - mamesan 進捗状況を報告します。 2週間たってやっと細胞が増えてきました。 フラスコは25cm2のtype Iコラーゲンコートを使い、培地は10%FBS and Antibiotic-Antimycotic in alpha-MEM(グルタマックス）です。 コラーゲンコートしていない100cm2ディッシュにまいた細胞も増えてきました。 培地交換は週2回であとはほったらかしです。 細胞の形態はATCCのRAW264.7の右の図のような形でコロニーの中心の細胞は一部多核になっているものもあります。 http://www.atcc.org/Attachments/2005.jpg full growthする前に何回か継代し、安定したgrowthが得られてきたらcolony formation assayやosteoclastgenesis等で細胞の分化能等をチェックし、実験に供しようと思います。 RAW264が元々保持していた機能と比較しておかしくなっていた時も想定し、一応細胞も取り寄せて培養しています。 今回の件、思い当たる節がいくつかあって、それをいろいろ考えていたのですが、やはり細胞を凍結した時の操作が悪かったと思います。 ちょっと恥ずかしくて書き込めないのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.530-4 - 2009/05/24 (日) 10:23:07 - Tb 細胞は生きかえるけど状態がおかしいという今回のケースに役立つかどうかわかりませんが、Webなどで探すといくつかのラボプロトコルとして次のような手順が書いてあります。 1) 融解した細胞溶液を50 mlのチューブに移す。 2) 培地をチューブを手で撹拌しながら一滴一滴ゆっくりおとして10-20倍量程度にする 3) そのままプレートにまくか、遠心して新しい培地にしてからまく。 ポイントは(2)で、凍結保存液と培地の浸透圧差によるショックを和らげることにあるようです。 初めて聞いたときはそんなめんどくさいことやってられないと鼻で笑いましたが、一度L cellの救出に成功したことがあり、それ以降すべての細胞でそうするようになりました。なれると全然めんどくさいと思わなくなりましたし。 あと、ATCCでは細胞保存液は10%ではなく5%のDMSOとして書いているものが多いように思います。RAW264もそうですよね。私のL cellの場合も5% DMSOにすると起きがよくなったと記憶しています。

(無題) 削除/引用 No.530-3 - 2009/05/22 (金) 20:03:05 - mamesan 私も同じトラブルが起きています。 私の場合、理研BRCからRAW264を取寄せて1年後に起したのですが、これはきちんと起きました。 しかし、ゴールデンウィーク前に凍結した細胞がなかなか起きません。 RAW264を凍結から起した際のviabilityは低いと聞いていましたが（40%程度）、私の場合は1割程度です。 8x10^6 cells/ml/バイアルで凍結 (10%FBS, Antibiotic-mycotic and 10% DMSO in DMEM or alpha-MEM) 9ml DMEM or alpha-MEMに上記の溶解した細胞を加え、type Iコラーゲンをコートした25cm2のフラスコにまいてます。 amiさんの方法は既にためしましたが、全く増えません。 細胞が丸くて強く接着しているようには見えませんし、growthが止まっているような感じです。 経験的にこういうそっぽを向いた細胞は10日間以上培養したら増えてくることがあるので、しばらく様子見です。 凍結の方法が悪かったのかも。。。（思い当たる節があり）

(無題) 削除/引用 No.530-2 - 2009/05/22 (金) 19:05:01 - ami 細胞がだめになっているとは思いますが、凍結されている細胞をそのまま10mlくらいの培地に懸濁し培養開始して、１〜２時間後に細胞が張り付いたら上清を交換、という手で遠心を避けてみるのはやってみてもよいと思います。

接着細胞の起こし方 削除/引用 No.530-1 - 2009/05/22 (金) 18:43:22 - ＄ 以前よりマクロファージでの実験を行っております。 過去に研究室でraw264細胞が使用されていたようなので、私も比較対象として液体窒素で保存されていたraw264細胞を起こして使用しようと思い、起こしたのですがうまく起きません（接着しない）。 10年ほど前に保存されたものなので、ひょっとしたらだめになっているのかもしれないですが私の手技に問題が有るかもしれないので何かアドバイスがあったらお願いします。ちなみにこの起こし方で以前から私が使用している細胞は起きてきます。 手順は以下です。 １，10^7cell/mlの濃度で1mlの用量で液体窒素中に保存(保存方法は分からない）されている細胞を恒温槽で温めて回りがとけたら20mlの培地の入った遠心管にいれる ２，4℃　1000ｒｐｍで5分遠心して上清を除去し、7mlの培地で懸濁する。 ３，２５ｃｍ2のフラスコに撒いてインキュベーターへいれる。 培地は10％FBSを加えたRPMI１６４０です。 よろしくお願いします。

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---