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(無題) 削除/引用 No.56-5 - 2009/02/20 (金) 14:44:28 - tomo 便乗して申し訳ありません。 私も、マウスの脾臓よりリンパ球を分離して、ＮＫ活性・サイトカインの定量を行っております。 基本的には、すべての工程を室温で行っておりました。 といいますのも、溶血は室温で、マクロファージの除去は37℃インキュベートで1時間、リンパ球採取のための密度勾配遠心は室温で20分間行うため、 その合間の作業のみ4℃にしてしまうと、むしろ温度の大きな変化が悪影響なのでは？と考えたからです。 このような場合も、やはり4℃で行うのが最適なのでしょうか？ トリパンブルー染色では、大体70〜80％の生存率を確認しております。 もうひとつ質問なのですが ＮＫ活性を測定する際、脾臓細胞中のマクロファージは除去する必要はあるのでしょうか？ 論文等を確認すると、密度勾配遠心のみのものが多く（この作業も無いものも多いのですが・・・）、マクロファージ込みでも問題はないのかな？と思うのですが？ 便乗してしまい、大変申し訳ありません。 ご回答頂ければ幸いです。 よろしくお願いいたします。

ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.56-4 - 2009/02/20 (金) 09:43:55 - 温度管理 やはり粘性物質は血小板などではなく、DNAだったように思います。 みなさんがおっしゃるように温度のせいではないですね。 赤血球を溶血させるときに浸透圧の関係で他の細胞までバーストしてしまったのでしょう。 溶血試薬は以下の組成を用いています。 NH4Cl　1.54g Tris　0.41g (pH7,4℃保存) 以前、常温の環境下で初代培養したとき、トリパンブルー染色した結果、80%以上の生細胞を確認したことがありました。 その後、生存率を確認したことはないのですが。 細胞がほとんど死んでいるとはどの程度なのでしょうか。 生存率（or致死率）はどのくらいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.56-3 - 2009/02/19 (木) 14:52:58 - genji Trisで赤血球除去というのがよくわからないのですが、lysing bufferか、NH4Cl等で普通は溶血させますよね。 この時の温度は37℃で5minぐらいインキュベーションを行います。 その後、RPMIを適当に加えて遠心（4℃）して細胞を回収します。 溶血以外のステップは全て4℃です。 ちなみに粘性物質じゃないですが、赤血球のカスがかたまって落ちることがあります。 まぁ、このカスは取り除くのもよし、細胞を撒くときに吸い込まないようにするのもよし、人それぞれだと思います。 ＞基本的に脾臓細胞は室温の処理では死にまくると思います。 制癌剤打って常温で脾臓細胞や骨髄細胞を回収するとめちゃめちゃ死にます。

(無題) 削除/引用 No.56-2 - 2009/02/19 (木) 13:54:14 - うーん 基本的に脾臓細胞は室温の処理では死にまくると思います。 ですので、全行程４℃で作業したのちwellにまいて初めて37℃に戻すという感じでやった方がいいと思いますが。 ４℃で粘性の物質が出てきた事はこれまでに一度もありません。 てかTrisはご存知のように温度で激しくpHは変動しますので、４℃用、室温用などTrisは作り分けた方がいいと思いますが。 たぶんその粘性の物質はDNAだと思われます。 細胞死んでるんじゃないですか。

マウス脾臓由来のリンパ球分離時の温度管理について 削除/引用 No.56-1 - 2009/02/19 (木) 13:35:51 - 温度管理 マウス脾臓からリンパ球を分離し、初代培養を行い、サイトカイン放出量を測定したり、NK細胞活性を測定したりしています。 おおまかな分離方法は、、、 脾臓組織をRPMI培地の中で平型のピンセットで潰し、Trisで赤血球除去を行い、単球除去試薬（KAC-2）を用いて単球除去後、残った細胞を回収して実験に用いています。 これまで何度もやってきましたが、温度管理があいまいでした。 操作の中で何回も遠心分離を行いますが、4℃で行ったり、室温で行ったりしていました。（これは機械により温度コントロールできる時とできない時があったためです） Trisなどの試薬は普段4℃で保管しているため、そのままの温度で用いており、赤血球除去後の細胞処理の段階では37℃に温めたRPMI培地を用いていました。 その方法で今までは細胞分離をしていましたが、温度管理が気になり、今回すべて低温での条件で細胞処理を行いました。 （冷RPMI培地、4℃での遠心分離） しかし、今回赤血球除去を行った後、粘性物質が発生し、その粘性物質を除去し、作業を続けましたが、その結果、細胞が回収できませんでした。 その粘性物質に細胞が含まれていたのだと思います。 今まではそういったことはなかったと思います。 いろいろ調べてみると血小板等の凝固物質が低温条件により活性化されたのではないかという見方が出てきました。 このように臓器から細胞を分離調製する場合の温度は室温（37℃）に保った方がいいのでしょうか。 また遠心分離する際も常温で行った方がいいのでしょうか。 何度も実験してきたわりには初歩的なところが解決できていないのですが、、、どなたかご回答よろしくお願い致します。

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