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(無題) 削除/引用 No.568-8 - 2009/05/28 (木) 17:18:04 - あべちゃん スプライシングバリアントの可能性は？

(無題) 削除/引用 No.568-7 - 2009/05/28 (木) 15:12:30 - M 短時間の間に多くのご回答ありがとうございます。 これまで5〜6種類くらいのターゲットに対してRNAiを行なったことがあります。 いずれも24〜48hのインキュベーションでタンパクもしっかり落ちていましたので、 今回もmRNAを24h、タンパクを48hで見ようとしていました。 mRNAの48hとタンパクの24hはおまけといいますか、細胞数に余裕があったのでやってみました。 mRNAとタンパク、それぞれに効果が出るのに時間差があるのは理解しています。 ウェスタンは2種類の抗体（マウス由来とラビット由来）で試しましたが、どちらも同様の結果でしたので、ウェスタンは問題ないかと思っています。 MK様の示されました可能性２だったらと考えると恐ろしすぎです。 タグ付けて･･･という方法はこちらの状況では難しそうです。 まずはノックダウン様のおっしゃるように一週間毎日サンプリングをして様子をみます。

(無題) 削除/引用 No.568-6 - 2009/05/28 (木) 14:12:44 - MK タンパク質の安定性が高いのを疑うのが普通だと思いますが、他の可能性としては １、抗体が別のタンパク質を認識している。 ２、realtime RT-PCRで検出しているmRNAが別の遺伝子由来のシグナルであり、siRNAもそれを標的にしてしまっている。（考えにくいとは思いますが） 解決策としてタグ付きの目的の遺伝子を発現させてsiRNAの効きを検証してみるというのはどうでしょうか？またその際にサイクロへキシミド等でタンパクの安定性も同時に検討してみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.568-5 - 2009/05/28 (木) 14:00:19 - み 安定性ですか・・・否定はしないけど４８ｈで差が見えないのなら抗体が見ているバンドが嘘物ということを考える方が良いのでは。

(無題) 削除/引用 No.568-4 - 2009/05/28 (木) 13:09:11 - c 安定性以外だったら、 見ているタンパク質がmRNA由来のものとちがう。 ウエスタンが変という可能性。

(無題) 削除/引用 No.568-3 - 2009/05/28 (木) 12:52:33 - ノックダウン トランスフェクションしてから、1週間くらい毎日サンプリングしてタンパクの量を確認した方がいいですよ。 タンパクが一番減っているタイミングで実験すれば良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.568-2 - 2009/05/28 (木) 12:01:53 - ・・・ mRNAと蛋白質レベルを同じタイムポイントでみているのは何故ですか？ お示しになった結果はリーズナブルに思えるのですが。

RNAi　mRNAレベルでは効いているのにタンパク発現量が落ちない 削除/引用 No.568-1 - 2009/05/28 (木) 11:42:09 - M よろしくお願いします。 invitrogenのStealth select RNAiを用いてRNAiを行なっています。 mRNAレベルではしっかりと抑制されているのですが （トランスフェクションの24および48時間後にreal time PCRで確認） タンパク質レベルでは発現量に変化がみられません。 （同じく24および48時間後にウェスタンブロットで確認） siRNAの量を変えても同様の結果です。 ターゲットは恒常的に発現しているタンパクなのですが、 タンパクの安定性が高くてなかなか分解されないのかと思い、 インキュベーション時間をより長くして再検討してみようと考えています。 他に何か考えつく原因、アドバイス等がありましたら教えていただければと思います。

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