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(無題) 削除/引用 No.575-23 - 2009/06/02 (火) 12:04:47 - IRES 一度FLAG抗体で免疫沈降をしてみることをお勧めします。 私もFLAGコンストラクト(膜タンパク質)でlysateでは検出できないが免疫沈降サンプルでは検出できたといったことがありました。 発現しづらいたんぱく質でありかつ膜タンパク質なので糖鎖修飾を強く受けている為、バンドがスメアーになり、lysateでは検出できなかった、検出しづらかった、と解釈しています。実際免疫沈降産物も予想よりかなり高分子量側にスメアーに検出されました。 コンストラクトの問題としては�T型膜貫通タンパク質の場合はシグナルペプチドを考慮しなければなりません。

(無題) 削除/引用 No.575-22 - 2009/06/02 (火) 11:13:28 - み >[Re:19] DCさんは書きました : > >[Re:10] ささんは書きました : > > ターゲットが（シグナルペプチドをもつ）分泌タンパクや膜タンパクではないですよね？念のため。 > > さ様、ご意見ありがとうございます。 > > 現在作製しているプラスミド5個のうち、2個は膜タンパクです。 > 分泌タンパクは含まれておりません。 膜貫通蛋白ならN末tagは検出できなくて当然ですね。シグナルペプチドと一緒にtagが切断されている？でもendoに対する抗体で少しは検出できても良い気がしますが。 残り３遺伝子は細胞内蛋白と仮定して、それらも上手くいっていないということは、他にも問題あるのですかね・・・。 Lysis bufferの検討ですか・・・endogenousなものを検出できる系でやっておられるのですよね。そこが問題なのかと疑問に思いました。FACSと染色とどちらがお得意なのか知りませんが、MockをコントロールにとってFLAG抗体で染まってなければやはり発現していないのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.575-21 - 2009/06/02 (火) 10:06:35 - DC >[Re:12] おおさんは書きました : > あとはおもちのpZeo昔から何回もトランスフォーメーション > をして増やしていて、たまたま悪いクローンを > 維持している可能性とかあるかもしれません おお様、いつも勉強させていただいております。 可能性はあります。 この可能性を見極めるためにも、現在行っているpcDNAへの組みかえの結果を 早く出したいと思っています。 > ウエスタンの感度も若干気になりますね。 > あとは1xFLAGを3x位にするとか、、、 > シグマがマルチプルなものをうってますよね。 ３XFLAGの発現ベクターは持っているのですが、一過性発現用です。 （安定発現株が取りたいので・・・） でも、ポジコンで用いているプラスミドは１XFLAGで検出できている（ECLで白抜けするほど・・・）なので、問題なくインサートと作れていれば同じように発現するのではと考えています。 > > pZEOのマップとかちょっとないのですが、 > マルチクローニングサイトの一番5'側をつかい、余計な > 配列を避けてみるのもてかもしれません。 これは初めて知りました。 こんな方法があるのですね。 検討させていただきます。 ご教授、感謝いたします。 >[Re:11] みさんは書きました : > 発現量・トランスフェクション効率の問題ならIPして濃縮するか、免染で観るかで考察できるでしょう。 み様、ありがとうございます。 まず、トランスフェクション効率についてですが、予めGFP発現のプラスミドを用いて条件を検討した上で、９０％ほどの導入効率のプロトコルで行っておりますので、問題はないかと考えています。 > ベクターのプロモーターが壊れていることもあるのでは？ この可能性はあると思います。 現在pcDNAに組み換えを行っています。 > 普段問題なく作成できてる人が上手く行かない時ってフレームやプライマーの設計ミスとか詰まらないミスが原因のことが多いですが。 すいません・・・今回が初めてなので設計はかなり心配です。

(無題) 削除/引用 No.575-20 - 2009/06/02 (火) 10:00:53 - あべちゃん >[Re:19] DCさんは書きました : > 現在作製しているプラスミド5個のうち、2個は膜タンパクです。 > さ様のご指摘のように、膜タンパクなので現在のウエスタンの検出方法では検出ができない可能性もあると考え、Lysis bufferの変更等行いましたが無理でした。 もう、検討済みかもしれませんが・・・ 膜蛋白質のサンプル処理方法について、このフォーラム内で何度か情報交換されていたと思います。 要点を言うと、低温で長目にサンプルバッファーで処理するというものだったと思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.575-19 - 2009/06/02 (火) 09:43:42 - DC >[Re:10] ささんは書きました : > ターゲットが（シグナルペプチドをもつ）分泌タンパクや膜タンパクではないですよね？念のため。 さ様、ご意見ありがとうございます。 現在作製しているプラスミド5個のうち、2個は膜タンパクです。 分泌タンパクは含まれておりません。 さ様のご指摘のように、膜タンパクなので現在のウエスタンの検出方法では検出ができない可能性もあると考え、Lysis bufferの変更等行いましたが無理でした。 なのでFACSにて確認たいと思っておりますが、こちらもポジコンとなる細胞株がないので・・・もしやってみてネガでも、抗体FACSの問題か発現の問題かわからなくなってしまう可能性があります。 ご指摘、感謝いたします。

(無題) 削除/引用 No.575-18 - 2009/06/01 (月) 15:36:35 - L あーあとは、 検出している抗体とかウエスタンのシステムをチェック。

(無題) 削除/引用 No.575-17 - 2009/06/01 (月) 15:32:25 - L 最初からやることは決まっているのでは？ みさんのおっしゃる通り、 使えるとわかっているベクターに組み込んで試す。 →インサートの問題かどうかわかる dさんがおっしゃる通り 今、遺伝子が入っているベクターに発現するとわかっている遺伝子を入れて試す。 →ベクターの問題かどうかわかる あとは、何の遺伝子かわからないので、可能性を揚げてもキリがない気が。 最初っから他人に言えるのは上の２つだけでは？

(無題) 削除/引用 No.575-16 - 2009/06/01 (月) 14:41:00 - み >[Re:15] dさんは書きました : > ちなみに、直接アポトーシスに関与するとかいう遺伝子ではなくても、 > いくら細胞に普通に発現している遺伝子でも、 > トランスフェクションで遺伝子を発現させるというのは過剰発現であるので、 > > 細胞に何らかの悪さを及ぼさないことは無いと思います。 >[Re:9] DCさんは書きました : > > ただ文献では、N末FLAGのものもあるのです（少ないですが・・・） > > 扱っている遺伝子全てが検出できないので、共通する大きなミスがあるのでは・・・と思っています。 遺伝子産物の性質が原因で発現しないことはこれで否定できますよね。 先日も言いましたがworkすることが確認済みのベクターに変えるのが一番速いと思いますが。まあ既にやられているのでしょうが。

(無題) 削除/引用 No.575-15 - 2009/06/01 (月) 14:08:42 - d ちなみに、直接アポトーシスに関与するとかいう遺伝子ではなくても、 いくら細胞に普通に発現している遺伝子でも、 トランスフェクションで遺伝子を発現させるというのは過剰発現であるので、 細胞に何らかの悪さを及ぼさないことは無いと思います。 というか、この手の実験をしている人だったら、発現しないということはよくあることだと 知っていると思うのですが・・・。 同じベクターで、例えばGFPとか絶対発現するであろう遺伝子をポジコンとして 実験しているんでしょう？（していないのなら、どうこう言う前にそれをすべき） ポジコンでいけるのに、その遺伝子ではダメだったら、それが真実なんですよ。 そういうときは他の実験を考えるとかしないと、時間の無駄だと思います。 みんなそうやっていると思うのですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.575-14 - 2009/06/01 (月) 10:56:04 - d その遺伝子が、細胞に悪影響を及ぼすようなものであったら 見た目上、発現していないように見えます。 どういうことかというと、 極端な話をすれば、アポトーシスを引き起こす遺伝子の場合は 高発現した細胞はいなくなりますし、 細胞周期を止めてしまう遺伝子の場合は、 高発現した細胞は細胞分裂せずに、細胞集集団のなかで数が少なくなってしまうとかです。 なので、一概に発現量が少ないとかベクターのせいに出来ない場合あがりまくりと思います。

ユビキチン化？ 削除/引用 No.575-13 - 2009/06/01 (月) 09:36:29 - ats 高分子領域に怪しげなスメアー状の像はみえませんか？ 以前、同様の発現実験でウェスタンブロットにて目的サイズにバンドが確認できないときがありました。このときは、スメアー状の像もなくスタッキングゲルとランニングゲルの境あたりに染みのようなものが見えるときがありました。 MG132などのproteasome inhibitorで細胞を処理すると目的サイズにバンドが確認できるようになりました。このため、発現直後から（正常にfoldingされづらく）迅速にポリユビキチン化され分解されるのだろうと推測しました。なおユビキチン化は別の実験で確かめました。 ポリユビキチン化の可能性はないですか？

(無題) 削除/引用 No.575-12 - 2009/06/01 (月) 04:12:35 - おお CMVは非常に強いといわれていますが、SV40でダメかなあというと ちょっと不思議に思いますね。 (kozac)(atg-１ｘFLAG)(target gene) なのですが、この辺がうまくいってないのでしょうか、、、、 例えばpCDNAやpCMV-flagのATGの前後の配列を使うと 機能的にうまくいっている物を使うわけですから 確率は高くなると思います。 あとはおもちのpZeo昔から何回もトランスフォーメーション をして増やしていて、たまたま悪いクローンを 維持している可能性とかあるかもしれません (ほとんどそんなことはないはずですが、たまたま そういう人が周りにいましたので)。 ウエスタンの感度も若干気になりますね。 あとは1xFLAGを3x位にするとか、、、 シグマがマルチプルなものをうってますよね。 pZEOのマップとかちょっとないのですが、 マルチクローニングサイトの一番5'側をつかい、余計な 配列を避けてみるのもてかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.575-11 - 2009/05/29 (金) 23:40:16 - み 発現量・トランスフェクション効率の問題ならIPして濃縮するか、免染で観るかで考察できるでしょう。 ベクターのプロモーターが壊れていることもあるのでは？ インサート作成やコンストラクション・細胞発現・検出のテクに問題ない人ならベクターをさっさと変えた方が良いのでは。 普段問題なく作成できてる人が上手く行かない時ってフレームやプライマーの設計ミスとか詰まらないミスが原因のことが多いですが。

(無題) 削除/引用 No.575-10 - 2009/05/29 (金) 23:10:59 - さ ターゲットが（シグナルペプチドをもつ）分泌タンパクや膜タンパクではないですよね？念のため。

FLAG配列と抗体について 削除/引用 No.575-9 - 2009/05/29 (金) 21:35:01 - DC あべちゃん様、ありがとうございます。 FLAGの配列はSIGMAのサイトから（１XFLAGの）引用しました。 ポジコンに使ったプラスミドは他のラボにお願いして、発現チェックをパスしているものを頂きました。 コンストラクトはｐｃDNA-１XFLAG・・・とありますので、あべちゃん様のご指摘の通りだと思います。 あと抗体についてですが、最初M2で検出できなかったためM5も試しましたがダメでした。 5個中3個の遺伝子はC末にモチーフをつけているので、N末にしかFLAGはつけれない状況です。 残り2個についてはC末FLAGもやろうと思っています。 ただ文献では、N末FLAGのものもあるのです（少ないですが・・・） 扱っている遺伝子全てが検出できないので、共通する大きなミスがあるのでは・・・と思っています。 他にもお気づきの点がありましたら、ご教授ください。 ありがとうございました。

SV40 promoter 削除/引用 No.575-8 - 2009/05/29 (金) 21:23:59 - DC 通りがかり様、ありがとうございます。 SV40のプロモーターは一般的にCMVより発現が弱いと考えてよろしいのでしょうか？ 実は、早く安定発現株を作りたくて２９３Tに導入するのと同時にひと培養細胞株にも導入し、一応クローンを得ています。 ２９３T、培養細胞ともにウエスタンでは検出できなかったため、 FLAGとターゲットを発現していないとかからないようなプライマーを作製し、培養細胞のクローンを用いてRT-PCRを行ったところ、検出できているのです。 なので、とても弱いですがｍRNAレベルでは発現はしていることが分かりました。 もしこのプラスミドのデザインがおかしくないならばLargeT抗原を持つ細胞なら過剰発現が見られるハズと思い、COS−１にtransfectionしました。 ２９３TもLargeT抗原を持つはずなので、こちらでも過剰発現が見えないとおかしいのですが・・・ 切り出してpcDNAに入れてみます。

(無題) 削除/引用 No.575-7 - 2009/05/29 (金) 21:19:53 - あべちゃん ポジコンとして、rabbit reticulocyte extractやwheat germ extractなどin vitro translationしてみてはどうでしょう？ あるいは、「この細胞でこの刺激をしたら発現誘導される」とかいった情報はないのですか？

ご助言、ありがとうございます。 削除/引用 No.575-6 - 2009/05/29 (金) 21:08:57 - DC ターゲットに対する抗体でのウエスタンも行いました。 全くバンドが得られません。 もしくはエンドでの発現が見られる場合でも、過剰発現は認めませんでした。 というよりも、ターゲットのポジコンがないので、 今使用している抗体が本当にターゲットを検出しているのか疑わしいと思い、それを確認するためにFLAGをつけた次第です。 ご助言、感謝いたします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.575-5 - 2009/05/29 (金) 20:01:19 - 通りがかり pZeo って SV40 プロモーターを使ってるやつじゃないですか？ だとしたら pcDNA（CMVプロモーター）より格段に発現は弱いですよ。

(無題) 削除/引用 No.575-4 - 2009/05/29 (金) 19:26:05 - あべちゃん ポジコンに使ったコンストラクトもN末側から Met-FLAG-目的蛋白質 の並びですか？ Sigmaで売られているFLAGの抗体にはM1からM3と、いろいろな種類があって、N末にないとだめ（Metが付いていてもだめ）とか、endoのFLAGエピトープでも検出可能なものとかあります。 そういったところは大丈夫ですか？

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