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DMSO 削除/引用 No.642-9 - 2009/07/28 (火) 14:30:09 - mom-a ＞私は高次構造を組みやすい鋳型のシークエンスにはDMSOを添加します。普通のPCRの時にDMSOを添加するのと同じ感覚ですね。 ＞shRNA発現ベクターのシークエンスの際にも効果があった経験があります 私もDMSO添加してシークエンスして上手くいきました。ちなみに、DMSOの最終濃度は4％でした。

(無題) 削除/引用 No.642-7 - 2009/07/04 (土) 02:10:13 - そば 物凄く遅いレスで申し訳無いですが。 私は高次構造を組みやすい鋳型のシークエンスにはDMSOを添加します。普通のPCRの時にDMSOを添加するのと同じ感覚ですね。 shRNA発現ベクターのシークエンスの際にも効果があった経験がありますし、良かったら試してみてください。

(無題) 削除/引用 No.642-6 - 2009/06/12 (金) 18:26:34 - あべちゃん sequencingのときの反応は、PCRとは言わないと思います。 primer extensionです。細かくてすみません。連鎖反応してないですから。

(無題) 削除/引用 No.642-5 - 2009/06/12 (金) 13:23:05 - ノック 様々なアドバイスありがとうございます。 まずは手っ取り早くできそうな、テンプレートのボイルなどを試してみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.642-4 - 2009/06/11 (木) 23:26:58 - D SeqPCRをかける前にテンプレートを98℃で10-20分ぐらいあらかじめボイルしてdenatureした後にPCRにかけてみてください 色々やるよりこれが一番早くて確実だと思います

(無題) 削除/引用 No.642-3 - 2009/06/11 (木) 19:09:29 - あべちゃん ホルムアミドを多めに入れる。 あるいは ループに制限酵素サイトを入れておき、リニアDNAを読む。ループに制限酵素を入れている例として、以前、この掲示板でSigmaのものを紹介して頂きました。

(無題) 削除/引用 No.642-2 - 2009/06/11 (木) 18:23:18 - とも shRNAを作る場合シークエンスがうまく読めないことは多々あります。 その解決方法としてはshRNAのセンス鎖側にポイントミューテーションを入れることで解決します。 クローニングしているときに何個かクローンを拾ってシークエンスしていくとたまに読めるものがあります。その時は変異が入っていますよ。 それとPCRでインサートを確認するときライゲーションのときのoligoがコンタミして、インサートが入っていないにも関わらずバンドが出ることがありますので、PCRで確認するときはベクター側のプライマーとインサート側のプライマーでPCRかけると正確に検出できます。

shRNA ベクターのシークエンス 削除/引用 No.642-1 - 2009/06/11 (木) 17:54:10 - ノック 現在ベクターを使用したRNAiの実験を計画しております。 pENTR-U6ベクターにshRNAをコードしたオリゴをを組み込み、PCRでインサートが入っていることを確認しました。 シークエンスを行ってインサートの確認を行ったのですが、 ３種類のshRNAのベクターどれも全く読めていませんでした。 インサートの前後どちらからのPCRでも駄目でした。 もちろん同時に行った他のshRNAベクターでないもののシークエンスはうまくいっているので、シークエンス自体に問題はないことは確認しております。 ヘアピン構造のためシークエンスが難しいということは聞いたことはあるのですが、ヘアピンの配列は ttcaagagaを用いており、このヘアピンを切断できるような適切な酵素もありません。 どのたか、ヘアピン構造をシークエンスするために良い方法がございましたら、教えていただけないでしょうか？ よろしくお願いします。

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