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(無題) 削除/引用 No.75-4 - 2009/02/26 (木) 13:22:15 - K ハギノコさん > サンプルはヒト血漿のサンプルを用いて二次元で解析しているんですが、やはりサンプルによって塩の除去が足りないってことってあるんですかね。 いえ、この場合の塩とは、銀染色を脱染色したときに生じるもの、という意味です。 > ちなみ質問なんですけど、ZipTipを用いる場合は直前に完全乾燥させてからZipTipを用いていますか？ 　おっしゃっている意味がわからないのですが・・・ ZipTipを使うときはどういうプロトコールでなさってますか？ゲルからペプチドを抽出しますが、その抽出液を完全にとばしてしまうんでしょうか。そうするとペプチドがチューブ内に吸着して回収しにくくなると思います。

(無題) 削除/引用 No.75-3 - 2009/02/26 (木) 01:57:59 - ハギノコ Kさんアドバイスありがとうございます。 サンプルはヒト血漿のサンプルを用いて二次元で解析しているんですが、やはりサンプルによって塩の除去が足りないってことってあるんですかね。 いまいち、どんなときに塩が多く含まれるのかがあんまりわからずに本などを参考にしてアレンジしてみたプロトコールなのでどれだけ脱塩できてるかなどの感覚がわからないんです。 ちなみ質問なんですけど、ZipTipを用いる場合は直前に完全乾燥させてからZipTipを用いていますか？

(無題) 削除/引用 No.75-2 - 2009/02/24 (火) 03:30:48 - K Lys-Cが問題ということではないように思えます。 ご自身ですでに答えを見つけていらっしゃるように、サンプルに含まれる塩が 結晶化を妨害しているのではないでしょうか。 私自身は常にZipTipで脱塩濃縮をしているためかLys-C、Trypsin共にご指摘のような 問題に遭遇したことは（幸運にも）ありませんでした。 銀染色のゲルを用いられているのでしたらまず脱塩をお薦めします。洗浄回数が少ないように 見受けられました（サンプルによりますが）。

Lys-Cゲル内消化後のMALDIプレート上の結晶状態 削除/引用 No.75-1 - 2009/02/23 (月) 21:01:02 - ハギノコ MALDI TOF　MSを用いてタンパク質を同定する研究をしているものですが、どうしてもLys-C（和光純薬工業）でゲル内消化後そのまま、MALDIプレートにサンプルをうつとサンプルがなかなか乾燥しないようで光沢がのこるような結晶ができてしまいます。 このような結晶状態の場合、サンプル解析を良い結果が得られない印象があるので、このような現象はおこるものなのかと思い質問させてもらいました。 ただZipTipを用いて脱塩濃縮するとそのような現象はなくなるのでなにかしらの影響があるのではないかとは考えてはいます。 ちなみにプロトコールとしては、Lys-Cに添付されていた和光のプロトコールを基に改変して使用しています。 1、二次元電気泳動後銀染色したゲルを50 mM チオ硫酸Na, 15 mM フェリシアン化カリウムで脱銀染色 2、MiliQで振とうし洗浄×３ 回 3、アセトニトリルで振とうし脱水 4、エバポレーターで乾燥 5、酢酸5%メタノール50 %の脱水洗浄液で30 分振とう×4 回 6、100ｍM重炭酸アンモニウムで振とうし膨潤 7、アセトニトリルで振とうし脱水 8、エバポレーターで乾燥 9、Lys-C 10 μg/μlで10 μlでプロテアーゼ消化16時間 10、0.1 % TFAを含む70 % アセトニトリルでペプチド抽出 （二次元電気泳動時に還元アルキル化済み） どんな些細なことでもいいので、アドバイスなどありましたらよろしくおねがいします。

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