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皆様ありがとうございました 削除/引用 No.80-8 - 2009/02/28 (土) 07:44:44 - 旅のカラス 通りすがりさん、Pumpkinさん、メッセージありがとうございます。 せっかくメッセージ頂いたのに、風邪で高熱を出してしまっておりお返事が遅れる失礼をお詫び致します。 さて、皆様のメッセージ通りにゲル、Bufferを交換した電気泳動を先程やってみたところ、綺麗にRNAのバンドが検出できました（5S rRNAのバンドも見え、量的にも問題無かったようです）。正直、RNA抽出の間は分解に気を使っていましたが、泳動中でこんなにも分解するとは思っていませんでした。経験者の方々の暖かいアドバイスに感謝します。同時に行った、新品ゲルー古いBufferでの電気泳動でも、やはり分解されてしまっていたので、ゲルとBufferはその度に配慮しながら作ったほうが良い様子ですね。大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.80-7 - 2009/02/24 (火) 21:19:34 - Pumpkin 作り置きゲル＆バッファがRNaseに汚染しているいうのに1票。RNAの確認には非変性でTAE/アガロースゲルで問題ありません。28Sと18SのrRNAが2本と量がのっていれば5S rRNAも下の方に見えます。ただ、LiClとかで落としていると低分子RNAはのぞかれるので見えませんが。 で、私はものぐさして、DNA用になんの気遣いもされていないTAE/アガロースゲルで、何の気遣いもされていない電気泳動槽で流して、みごとにスメアーになったことがあります。それ以来は、電気泳動槽などはRNase Zapで拭いて、ゲルやTAEはRNase Free Waterに溶かして、おまじない程度にオートクレーブして使っています。試薬調製用のビーカーなどは250℃3時間ほど乾熱かけています。最近はアジレントのバイオアナライザーで検定するので、TAE/アガロースゲルで見ていません。TAEの温度は、普通の電気泳動と変わらなければ特に問題ないかと。むちゃくちゃ熱ければ、なにかおかしいです。 RNAを取扱いするチップやチューブはRNase Freeの新品ですか？詰め直したりしたものでなく、それ専用に使った方が安心です。RNeasyは定評のあるキットですので、プロトコル通りやっていれば問題ないと思います。2か月程度過ぎたからと言って問題ないですが、倫理的に大丈夫とは明言できません。1年以上前のものでも、カラムは問題なく使えています。流石に試薬は使いません（蒸発分とか怖いので）。 まずは、細心の注意を払って電気泳動をやってみるとよいと思います。それでも同じようにスメアーで輝度のたかいrRNA像が得られなければ、抽出したRNAが分解されています。ちなみにナノドロップはDNAとRNAを分別定量できませんので、DNAの混入がある場合にはプラスの値が出ますよ。

(無題) 削除/引用 No.80-6 - 2009/02/24 (火) 16:30:46 - 通りすがり 私が昔所属していたラボでは、培養細胞からRNeasyで RNAを回収していましたが、その際はただの1x TAE アガロースでRNAの純度をチェックしていました。 ただしRNaseのコンタミを避けるため、バッファは RNA専用でしたし、ゲルも必ず用時調製していました。 よって、yamaさんもおっしゃっていますが、 >作り置きのゲルとバッファ あたりを気にしてみてはいかがでしょうか。 それと念のため、サンプルはロード前にボイル(熱変性)して ありますよね?

(無題) 削除/引用 No.80-4 - 2009/02/24 (火) 16:21:48 - 旅のカラス yamaさん、aimerさん、メッセージありがとうございます。 これまでに酵母を扱ったことがない研究室ですので、定法と異なっている所も多いのかと思います（先輩は動物細胞よりRNAを抽出するのにRNeasyを使っており、プロトコールを調べたところ酵母での方法もあるので、それを使ってみようと思った次第です）。私個人としては、RNAを用いた経験自体ないので現在戸惑いながらの実験でもあります。色々と暖かいコメントを頂けて、嬉しく思っています。酵母では、ホットフェノール法が一般的とのことですが、酵母では特に気を付けないといけないことなどあれば教えて貰えると嬉しいです。 泳動ですが、確認泳動には1×TAE,アガロースゲルを用いたDNAと同様の方法でも十分と研究室のプロトコールではあったのですが、やはりできるだけ繊細に行った方がいいのでしょうか。今回の泳動では気を使わず、作り置きのゲルとバッファーで行いました。また、mupidを使って30分泳動しているので、TAEの温度は上がり気味なのですが、そうしたことも関係してしまうのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.80-3 - 2009/02/24 (火) 15:49:27 - aimar ゲルにホルムアルデヒドいれないんですか？ キットをつかった精製法はプロトコルが異なるんでしょうか？ 私は酵母からのRNA抽出にキットを使ったことはなく、毎度ホットフェノールですが。

(無題) 削除/引用 No.80-2 - 2009/02/24 (火) 15:33:50 - yama total RNAを抽出して泳動した場合、rRNAのバンドが二本のみが見えます。 ですので分解されたと考えられると思います。 問題はその分解が抽出時なのか泳動時なのかです。 RNAを泳動した時には何分ぐらい泳動しましたか？ アガロースゲルは新しく作りましたか？ その他泳動中に壊れた可能性はありませんでしょうか？ キットの使用期限はそれほど問題ないと思います。 酵母からのRNA抽出方法ですが、ホットフェノール法が一般的ではないかと思います。

RNeasy Kit (Qiagen)を用いた酵母からのRNA抽出 削除/引用 No.80-1 - 2009/02/24 (火) 14:42:20 - 旅のカラス 始めまして。分子生物学を最近用い始めた初心者ですが、いつも興味深く拝見させていただいています。 今現在、酵母からのRNA抽出のために、QiagenのRNeasy mini kitを用いています。最終生成物をnanodropを使い濃度測定すると、600ng/μlぐらい取れて安心したのですが、1.5%アガロースゲル、TAEを用いた電気泳動で確認してみると、100bp-2kbpぐらいの広い範囲のスメアとなってしまっていました。 この結果は、RNAを分解してしまったと解釈するべきなのでしょうか。RNAのバンド自体は、2kbpよりもっと短いと聞いていますので、それが壊れたにしては長すぎるスメアだと訝しんでいます。また、Kitが研究室の先輩が用いていた少し古い物（使用期限を2ヶ月ほど過ぎている）ですので、そのせいでDNAがコンタミしたのか？とも思うのですが、この手のカラム精製によるキットではDNAのコンタミは起こりにくいとネットで検索する限りは聞きますので、実際に使われた方からご意見をうかがいたいと思いました。 追加でやや各論的な質問なのですが、酵母からのRNA抽出には、最初の酵母の破砕について酵素を用いたプロトコルと、ビーズショッカーを用いたプロトコル両方が用いられるようです。私の研究室は地方で、薬品が届くまでに時間がかかることもあり、共用機器にあったビーズショッカーを用いて抽出を行ったのですが、ここに原因がある可能性もあるでしょうか？酵母の場合の、最初の破砕のコツなど教えて貰えると嬉しいです。

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