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(無題) 削除/引用 No.1235-18 - 2009/09/29 (火) 22:48:48 - qq 混乱させているような気がしますが、一応返答します。 全体としてはmom-aさんの言う通りです。さらに、mom-aさんの示されたリンク先は、よくわかるpdfがあります。ご一読されるとよろしいです。 >多項式近似でも横軸に濃度を作成した方がよいのでしょうか？ 三次式でフィットするなら、縦軸を濃度：横軸をABSかなあと思うのですが、ご自身で試行錯誤してください。 >それとも、私が濃度を対数にしていないのがいけないのでしょうか？ 濃度を対数に変換する必要があるのは、ロジスティック曲線のときだけです。詳細は、mom-aさんの示されたリンクを確認してください。

ソフトに弱いもので… 削除/引用 No.1235-17 - 2009/09/29 (火) 11:02:04 - mom-a 私は通常JMPの非線型回帰で計算するのですが、ざっとグラフを描いてみたところ（0値データをのぞいたもの、0値データを最小値の1/2の位置に入れたもの）やはり飽和には達していないものの、上下が直線部分からはずれて寝てきているようで、ロジスティック回帰の方が当てはまりがよいように見えます。 ImageJでの使い方はわからないので何ともアドバイスのしようがありません…。 あまり色々なことを言われると混乱するでしょうから、深入りしすぎないようにご自分で判断されていただきたいですが、下記のアドレスから日本語の資料及びExcelでの計算用ファイルが入手できますので、参考に挙げておきます。 http://www.yukms.com/biostat/haga/download/likelihood.htm こちらから資料をダウンロードし、「2.3ロジスティック曲線のあてはめ」を参考にされると良いと思います。…といいつつ、自分で計算してみていないのですが…明日くらいまでには目を通しておけると思うのですが…。

(無題) 削除/引用 No.1235-16 - 2009/09/29 (火) 00:58:30 - ごまたろう RR様ありがとうございます。 すでに私の理解域を超えてしまってるように感じます；； 今回の私の結果（No.1235-4のスタンダード）をEXCELを用いて、 メーカーの言うようにシグモイドといっても多項式近似を使う場合、 横軸に濃度、縦軸に吸光度を設定すると（メーカーはこのようにこのように横軸に濃度を設定してシグモイドの3次曲線を作ると言っていましたので）、やはりマイナス値がでてしまいますし、計算式がy = 8E-12x4 - 2E-08x3 + 9E-06x2 + 0.0015x - 0.0179 R² = 0.9981という難解なものになってしまいます。 多項式近似でも横軸に濃度を作成した方がよいのでしょうか？ それとも、私が濃度を対数にしていないのがいけないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1235-15 - 2009/09/28 (月) 21:40:57 - qq ロジスティック曲線は、S字型曲線・シグモイド曲線の表現形式ですよね。（きっと） ですから、横軸を濃度の対数に選んで、縦軸を吸光度に選んだときにそんなグラフになります。 これをカーブフィットするときは、Radbardを選択するのが宜しいと思えます。 具体的にはこんなデータです。 ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ 濃度はここでは、10^-6から10^0の範囲と言う意味です。 濃度ABS -6 0.01 -5 0.05 -4 0.2 -3.5 0.5 -3 0.75 -2.5 1.0 -2 1.5 -1 1.8 0 1.92 ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ 一方で、濃度に対して吸光度をプロットする場合には、単純な飽和曲線へ当てはめるのが適当だと思えます。 このままロジスティック曲線に当てはめると、シグモイド曲線の上半分（もしくは下半分）だけで当てはめていることになるので、不適当な結果をもたらすかもしれません。 そんなときは、 y=a/(1+x/b) もしくは、 y=a/(1+x/b) + c + d*x ｛blank付きの式｝ を使ってカーブフィットするのが、論理的であるように思えます。が、そこまでする必要があるのかというと、何とも言えません。 ImageJでは、Curve fittingのなかに’user defined’があるので、ここに式を入力すれば、可能ではあります。 Rodbard NIHimageは、変数・関数を逆転させたグラフです。これは、フィットして得られた関数を用いて、ABSから濃度を算定する時に使うためにあるのだと考えています。（現実的でしょ？） 実際にあなたが1235-4で示したスタンダードですが、まだまだ飽和していないように見えます。ロジスティック曲線をもちだすには不十分もしくは不必要ななデータだと思います。 この様な条件では、メーカーが言うような単純な多項式を用いたり、直線近似も有効であるのかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.1235-13 - 2009/09/27 (日) 22:47:52 - ごまたろう rr様、ありがとうございます。 ＞fitting　curveからrodbard NIH imageを選択すると良いかもしれません。 確かに、マイナスの値は表示されませんでした。 同じロジスティックの計算式なのに、これほどグラフが違うとは驚きました。 R2値も大きく違うみたいですし・・・。 R2は最初の方（Rodbard）が0.996で、rodbard NIH imageのR2＝0.987と違いもでるみたいですね。グラフ自体もrodbard NIH imageのほうがずれているようにみえます。 これで、いいのかなと思いつつ、素人は手を出してはいけないのなかという 気持ちになってきました・・・。

(無題) 削除/引用 No.1235-11 - 2009/09/26 (土) 23:58:30 - ごまたろう in situ、qq様どうもありがとうございます。 販売元では（ジグモイド曲線を使用しているそうですが） EXCELでも曲線になってるから大丈夫なんじゃない？とういような 言い方であいまいですが、それで問題ないとも断言しておられましたので、 安心してしまっていました。 やはり、みなさまのアドバイスの通りにやってみたいと思います。 そこで、何度も申し訳ありませんが質問したい点がでてきました。 もしお時間がありましたら、アドバイスをよろしくお願いいたします。 qq様にアドバイスいただいたhttp://rsb.info.nih.gov/ij/から ソフトをダウンロードして使ってみたところ、 ０点を含めてしまうと吸光度の低いところではマイナスに入って しまいます。 �@通常はX軸にサンプル濃度、Y軸に吸光度を設定してよいでしょうか？ その場合、０点は含めないで測定した方がよいですか？ ０点を含めましたので、吸光度が低いもの（たとえば、今回は吸光度が0.031 のものがありましたが-0.016699078という濃度になってしまいました。 �Aまた、このソフトではグラフが作成されている画面（y = d+(a-d)/(1+(x/c)^b)が題されている画面）ではR^2＝0.999と表示されますが、Logと題される画面ではR^2: 0.9986と表示されます。 これはどうしてなのでしょうか？ 何度もこのような質問をして申し訳ありませんが よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1235-10 - 2009/09/26 (土) 21:12:26 - qq ロジスティック曲線を書いてくれるソフトをお探しであれば、ImageJをお勧めします。ImageJは、もちろんグラフソフトではないのですが、強力なグラフ機能を持っています。 アドレスは、以下のとおりです。 http://rsb.info.nih.gov/ij/ インストールしたとして、 ImageJを起動して、 Analyze/Tools/Curve Fitting... を選ぶと、データ入力ウィンドウが開きます。 defaultで適当なデータが入っていますから、とりあえずそのまま使ってみるとよろしいでしょう。 種々のfitting curveが用意されています。ロジスティック曲線はRodbardを選択するとよろしいです。 式と係数、R2その他が表示されます。

(無題) 削除/引用 No.1235-9 - 2009/09/26 (土) 15:38:26 - in situ シグモイドの近似に三次式や四次式を使うのは自分はお勧めできません。 というのは、シグモイドは濃度を小さくしていくとブランクの値に、大きくしていくとsaturateしてやはり一定の値に収束するという性質が重要なわけですが、整式では次数を上げようともこの性質は表現されません。 今回のデータを使って四次式で近似したところ（EXCEL使用）、案の定600と1200の間に極値があるという謎な曲線が表示されました。 メーカーさんの言っていることと違って申し訳ないのですが、自分としては １．ロジスティック曲線を描いてくれるソフトを探す。 ２．今回の1200といったsaturateし始めている点を除いて直線近似 のどちらかにしたほうが良いと考えます。

(無題) 削除/引用 No.1235-8 - 2009/09/26 (土) 00:04:38 - ごまたろう in situ、mom-a様 ご丁寧な回答どうもありがとうございました。 初心者の私にもわかりやすい説明で、感謝いたします。 キット販売元に確認したところ、シグモイドの三次曲線を利用することが 多いが、特に4次曲線でもかまわない、との回答をいただきました。 また、通常シグモイド曲線であれば、解析ソフトとかEXCELでも逆シグモイドを使用しないと作成できないと思いましたが、 EXCEL2007の近似曲線のなかで多項式近似をの次数をあげればよい、とのことでした。 （多項式近似出てくる計算式が四係数ロジスティック曲線とは違うと思うのですが、これで問題ないとの回答でした。） もう少し勉強する必要がありそうです。 毎日生体しか扱っていない私には、この数字ばかりの世界は頭が痛いです；；；。

(無題) 削除/引用 No.1235-7 - 2009/09/24 (木) 14:40:05 - mom-a すみません、参考文献などを紹介している時間がないので、わかりにくい書き込みになってしまってすみません。調べるきっかけになるかもしれないので、不十分を承知で書きこませていただきますのでご容赦下さい。 直線近似に関しては、in situさんのおっしゃるように、シグモイド曲線の直線部分を選んでいる、ということになります。メーカーの設定した検量線の範囲によって、ロジスティック曲線を描かせるメーカー、直線を描かせるメーカーとあるようです。4パラメーターロジスティック曲線を描くにはソフトを使うか、Excelですとソルバーが使える知識がないといけません。 あるいは、yをロジット、xを対数に変換すればグラフは直線になり、この方法ですと特殊なソフトを使用しないので、これを推奨しているメーカーもあるようです。ここでいう直線は「曲線の一部の直線」ではなく、曲線全体が直線に変換されます。 0の扱いですが、全体から引いてしまってもいいのかもしれません。シグモイド曲線にする場合は、裾野の高さにあたるので、カットするのではなく最低用量の1/10とか適当なところへ入れることが多いです。（なんて適当な！といわれそうですが、統計家の先生が「適当」とおっしゃるので…。） いずれの方法で検量線を描くにせよ、重要なのは↓だと思います。 >普通のELISAでしたら、サンプル値が検量線の測定枠に入っていることが望ましいようです。 ここに関してはAさん同様、 「検量線の測定枠に入っている値しか信じません」 直線近似で考えると分かりやすいと思いますが、曲線の一部をとってきて直線を引いているだけなので、検量線の範囲を外れたらどこから曲線になっていくかがわかりません。「必ず」測定枠の中にはいっていなければなりません！ シグモイド曲線の場合、検量線の測定枠内であるだけでなく、『直線領域以外は信用しない』というのも、グラフを見ていただければ感覚的に分かると思います。両端がどうなっているかわからない直線よりも曲線で検量線を描く方が個人的には好みです。

(無題) 削除/引用 No.1235-6 - 2009/09/24 (木) 01:50:07 - in situ すいません、一文が途中で切れていました。 >また、0点は また、0（陰性対照）は、やはりシグモイドの裾野に位置することになるのではずしたほうが良いと思います。 今回の場合、入れても入れなくてもあまり変わらないのですが、、

(無題) 削除/引用 No.1235-5 - 2009/09/24 (木) 01:44:28 - in situ 実際にグラフを書いてみました。 ELISAの場合、理論的には検量線はシグモイド（競合ELISAなら逆シグモイド）になるので、直線近似というのは、シグモイドの『濃度が低すぎず、高すぎない範囲においてほぼ直線性が成り立つ』という性質を利用しているわけです。 ちなみに、シグモイド、逆シグモイドの関数は四係数ロジスティック曲線というそうです。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=4618 今回、グラフを見た限りだと、特に高濃度領域においてsaturateしているようです。 また、0点は 今までのELISAのスレでの皆様の発言を鑑みるに、『直線領域以外は信用しない』という方が多かったので、素直に直線近似がきれいにできる領域にサンプルを希釈するなりして入れると良いと思います。 （ただ、シグモイド、逆シグモイドをソフトなどで描いているという方も（自分含む）いることはいるようです。） ちなみに、今回の場合、0と1200を抜かして直線近似をしたらR^2=0.987くらいになりました。 ４点で心もとなければ、75〜600の間にもう何点か取ってやればもう少し信頼性があがるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1235-4 - 2009/09/24 (木) 00:31:19 - ごまたろう ELISA様、A様、どうもありがとうございます。 必要に迫られ、スタートした実験で知識もなかったため、 質問内容も的を得ているのか不安でしたが、ご丁寧にアドバイスをいただきありがとうございました。 使用しているキットに添付されていた文書には、「標準品および陰性対象品の吸光度から標準曲線を作成。2重測定の平均を用いる」とは書かれておりましたが、検量線の参考は記載されておりませんでした。 （測定濃度から、疾患の有病・無病率の正診率などの参考内容は記載されておりましたが・・・） ELISAの検量線は直線近似が適応されないものもある、ということなのでしょうか？ 参考文献も調べてみたいと思います。 ちなみに、今回測定した結果です。 　　　　Standard(pg/ml)　　　吸光度の平均値 0(陰性対象）　　　　 0.058 　　　　75 0.1395 　　　　150 0.472 　　　　300 0.9025 　　　　600 1.61 　　　　1200 2.1835

(無題) 削除/引用 No.1235-3 - 2009/09/23 (水) 23:30:24 - A ELISAさんのおっしゃるようにどのような検量線を用いるべきかはキットに 非常に依存するでしょうからマニュアルで確認するなりメーカーに問い 合わせるのが良いでしょうね。 >普通のELISAでしたら、サンプル値が検量線の測定枠に入っていることが望ましいようです。 この部分に関しては私は検量線の測定枠に入っている値しか信じません。 貴重な検体とのことなので可能かどうかわかりませんがもし測定枠を超えて いるなら何らかの溶液で希釈して測定枠に収まるようにするべきだと思います。

Re:ELISAの標準曲線の作成法 削除/引用 No.1235-2 - 2009/09/23 (水) 23:20:11 - ELISA ELISAキットは何を測るものか分りませんが、キットのマニュアルに検量線の例が載っていませんでしたか？　例のグラフのR2値が同様に低いのでしたら、そのままで良いのではないでしょうか？　またサンプルが何かも分りませんが、キットのサンプル処理方法の指示通りにされるといいですね。キットには参考文献も出ていると思いますので、それも読んでみた方がいいと思います。カスタマーサービスなどへ問い合わせてみると、丁寧な応対をしてくれるところが多いですよ。 普通のELISAでしたら、サンプル値が検量線の測定枠に入っていることが望ましいようです。

ELISAの標準曲線の作成法 削除/引用 No.1235-1 - 2009/09/23 (水) 03:21:28 - ごまたろう 初心者からの質問です。 初めてELISA（キットを使いました）を行い、EXCEL(2007)を用いて標準曲線を作成しています。 散布図から近似曲線を選択し、直線近似を作成したところ、R2＝0.919となってしまいました。 指数近似にすると、ほぼ直線になりR2＝0.9815となるのですが、ELISAでは直線近似でR2が低い場合には手技ミスによると判断した方がよういのでしょうか？ 貴重な検体で測定したため、再検査することが難しいため、 アドバイスをよろしくお願いいたします。

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