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(無題) 削除/引用 No.216-22 - 2009/12/14 (月) 05:11:26 - Tb 古いトビに対するレスになりますが、EtBr廃液問題はけっこう頭が痛いことだと思いますので投稿します。 >[Re:19] MXさんは書きました : > 当方，最近EtBrに代えてGelRedを使用しはじめましたが，高感度（大雑把に言ってEtBrの10倍程度？）かつEtBrプレステインの際に見られる低分子域の”ぬけ”がおこらないため特に低分子DNAを可視化するのに重宝しています。通常のPCR産物を泳動するとプライマーに相当するバンドまで見えます。高価なのが欠点ですが，メーカー推奨希釈倍率よりも３−４倍薄くしても実用上問題ありませんでした。私自身はEtBrフリーの生活にとても満足していますが，他に使用している人からの経験談や欠点の指摘など聞くことができたら，と思っています。 > > 参考： > http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/gene/article/GelRed.htm MXさんご紹介のGelRedですが、本家BiotiumのWebではProduct Informationがrevisedされており（以下引用）、 Disposal GelRed has successfully passed environmental safety tests in compliance with CCR Title 22 Hazardous Waste Characterization. As a result, GelRed is not classified as hazardous waste, thus can be safely disposed of down the drain or as regular trash, providing convenience and reducing cost in waste disposal. For detailed test results on GelRed, you may download a complete safety report at Biotium website. と、流しに捨ててよいとあります。SYBR Safeもそのテストをパスしていますので、Biotiumの説明をそのまま当てはめると、SYBR Safeもそのまま捨ててよいのでしょうが、SYBR Safeの説明書は使用者の判断に任すという感じでよくわかんなかったですものね。 EtBrより感度がいいという点からも、乗り換えてみようと思っています。

違法性はないようですが・・・。 削除/引用 No.216-20 - 2009/03/30 (月) 16:34:29 - けろろ すいませんちょっと便乗させてください。 ＞EtBrはどんなに垂れ流しにしても法令上は何の問題もないはずですので、それが原因ということもなさそうですが。 私も一度調べたのですが、下水に流した場合は「廃棄物の処理及び清掃に関する法律」の適応範囲ではなく、また下水に関する法律である「下水道法」および「水質汚濁防止法」にはカドミウムとかの有名毒物の記述はあるもののEtBrについては記載が無いとのことで、原液を下水道に流しても全くお咎めなしとのことでした。（文部科学省と下水道局にも確認をとりました） またうちの大学にはEtBrに関する指針がなく、各研究者に任せている状態なので、自分は先染めゲルを使った時の泳動バッファーくらいはそのまま下水に流してます。 こんなことを書くと、そういう問題でなくモラルの問題と言われそうですが、皆さんはどのくらいの厳密さでやっていますか？

GelRed使用経験 削除/引用 No.216-19 - 2009/03/28 (土) 01:49:29 - MX 当方，最近EtBrに代えてGelRedを使用しはじめましたが，高感度（大雑把に言ってEtBrの10倍程度？）かつEtBrプレステインの際に見られる低分子域の”ぬけ”がおこらないため特に低分子DNAを可視化するのに重宝しています。通常のPCR産物を泳動するとプライマーに相当するバンドまで見えます。高価なのが欠点ですが，メーカー推奨希釈倍率よりも３−４倍薄くしても実用上問題ありませんでした。私自身はEtBrフリーの生活にとても満足していますが，他に使用している人からの経験談や欠点の指摘など聞くことができたら，と思っています。 参考： http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/gene/article/GelRed.htm

(無題) 削除/引用 No.216-18 - 2009/03/23 (月) 12:26:34 - コーチマン Stain eye使ってます。 感度はたしかに悪いです。 あと、我々のラボで問題になったのがゲルの撮影です。 EtBr-UVでの撮影に使っていた撮影機や 通常のデジカメ等ではきれいに写真が取れませんでした。 （最低限の写真にはなるのですが、論文に投稿できるレベルではありませんでした。） 結局、Stain eyeは切り出し用に使っています。 非EtBrという面ではコスモバイオのEZVisionを使ってます。 うちもEtBrの毒性が問題になったので。 EZVisionはNon-toxicをうたっています。 こちらもEtBrより感度は若干落ちますが、Stain eye以上ですし、 これまでのUV撮影の機材で写真が取れます。 以上ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.216-17 - 2009/03/23 (月) 12:07:25 - AP 不勉強でよく知らないのですが、MSDSは販売者が購入者や流通者に提示しなければならない危険性の告知であれば良くて、自前で検査したものでも公的機関の検査結果でも文献からの情報でも、availableな情報を使うもののようですね。 便利そうなサイトを見つけました。 ttp://hazard.com/msds/ 各社の記載するMSDSの検索はもちろん、toxity dataの検索では根拠となる文献tとそこで述べられている危険性、アッセイ方法、doseなどのリストが出てきます。たとえばEtBrなら、 ttp://www2.siri.org/msds/tox/f/q87/q957.html 個人的な感想を言えば、日常的な使用量からすればとんでもなく高いdose使っている（少量なら影響がないということにはなりませんが）ので、十分に留意して使う分には（fail safeを考慮しても）問題になるほどとは思えないんですが。 これは、質問への回答ではなく、わたしの勝手なイチャモンですけれど、 どんな試薬であれ適切な用法を前提として使われるのであって、パワーから言っても使用量からいっても、ちゃんとコントロールしなければ危ないものはもっといっぱいあります。そうでなければ、実験なんか出来ないし、大学はそういうことを訓練する場でもあるもあると思うんです。ある試薬を使用するとき、どうやれば安全に適切に作業や廃棄ができるか、そういうことに頭を使うのが大学であり安全管理だと思うのです。それなしに頭ごなしに使用禁止（あるいは制限）するというのでは、言葉狩りと同じような、思考停止、くさい物にふたのように感じます。よそ様の事情なので口を挟める立場ではないですが。 安全な代替品があるならそれに切り替えるのにはやぶさかではないですが、適切な用法に従うことに変わりないし、また完全に性能を代替できるとは限らないし、より安全だと言っても使用量が増えるようでは（後染めで比べた場合、繰り返し使えるEtBrのほうが圧倒的に少なくてすむはず）総合的な安全性が高くなっているのかも疑問で、ただの気休めじゃないかと思えてしまいます。 フォルムアルデヒドだとか、重合したら安全だからと信じて（本当はモノマーのままの残留物もある）アクリルアミドゲルや泳動後のバッファーを無防備に扱っていたり、しつけの悪いラボだと、こぼしたモノマーがベンチの上で白くこびりついていたりするとのを見たりすると、そのほうがよっぽど危険で、本当に怖いのは人の不適切な行動だと思うし、指導的立場の人は何をやっているんだろうと思いますね。 ちなみに、上記サイトでアクリルアミドは ttp://www2.siri.org/msds/tox/f/q6/q495.html

(無題) 削除/引用 No.216-16 - 2009/03/23 (月) 10:37:22 - 一知半解 Mupid-blueやMupid-Stain Eyeがだめだというわけではありません。でも、宣伝文句はともかくも、ミニゲルでバンドあたり50 ngくらい無いとはっきりと見えません。EtBrなら5 ngでも見えますよね。切り出しなど量が十分な場合には有効だと思います。また、UVを使わないのでDNAのダメージが少ない点も切り出しに相応しいと思います。ステップの多い切り出しの方が汚染の危険性が高いと考えられるので、EtBrの汚染を避けるという意味では切り出しだけでもこれらの染色剤に切り替えるメリットは大きいと思います。 うちでは、切断パターンのチェック用に少ないDNAの時はEtBr（汚染を最小限にするため後染め）を、切り出しには市販品が高いので自前で調製したクリスタルバイオレット溶液を使っています。ナイルブルーも使えます。

沢山のアドバイスをありがとうございます 削除/引用 No.216-15 - 2009/03/23 (月) 09:50:33 - 旅のカラス 皆様、質問に非常に沢山のアドバイスをありがとうございます。纏めてのお礼で失礼をお許し下さい。 EtBrの安全性についても、具体的な資料を教えて頂き大変参考になりました。うちの先生にも、今日伝えておこうかと思います（ちゃんとした根拠があるEtBr外しだといいんですが...結構急にムチャを言われることも多いのでどうなのでしょう）。 多くの方のアドバイス通り、感度が必要な条件はSYBRSafe、感度が重要じゃない条件ではMupid-blueなどの併用を先生に提示してみます（Mupid-blueについては、実際に使われている方はそういないこともわかりましたが（汗） なお、多くの方が興味を持って議論していただいているので、水曜日ぐらいまで解決扱いにはしないでおこうと思います。何か便乗でもご意見あれば書き込んでくれると勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.216-14 - 2009/03/22 (日) 00:40:57 - CDRT 一知半解さん、その点、まったく同感です。使用者は公開された情報を基に判断するしかないですからね。また、エチブロのMSDSでも、DNA damageとだけでなく、その論拠となる具体的な論文を示してもらいたいのに、とは思いました。審議会による総合的な判断だから、ということではあるのでしょうが。

(無題) 削除/引用 No.216-13 - 2009/03/21 (土) 23:46:15 - 一知半解 CDRT様、 詳しい資料をお示しいただきありがとうございました。SYBR Safeが標準的とされる多くのテストで問題無しと出ているということが良くわかりました。 この資料で気になるのは、同じアッセイを平行してEtBrに対して行ったデータが挙げられていない点です。にもかかわらず、２つ目の資料のExecutive Summaryのところに、さらっとIn contrast, ethidium bromide tests positive in the SHE cell assay, consistent with its known activity as a strong mutagen.とあるのは、データの扱いとしてはこれはちょっとフェアな態度ではないように思います。同じアッセイ条件ではEtBrも問題が認められなかったのではないかと邪推したくなります。SigmaのMSDSにある記載がどのようなデータを基にしたものかも知りたいところです。

(無題) 削除/引用 No.216-12 - 2009/03/21 (土) 22:20:13 - CDRT すみません、SYBRSafeです、スペルまちがえました。 >>EtBrと同様にDNAにインターカレートするタイプの蛍光染色剤なので、複製エラーを誘起するという点ではそれほど差異があるようには思われません。 ええ、その点は不思議ですが、 >>便乗質問なのですが、SYBRなんたらの発癌性や催奇性がEtBrよりも低そうだというのはどのくらい信憑性のあることなのでしょうか。 http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/Nucleic-Acid-Purification-Analysis/PDFs.Par.8760.File.dat/B-073241%20Sybr%20Safe%20Test_LRF.pdfのpdfのTable1にあるように、SHE cellでのtransformation活性、chromosomal abberration, forward mutationいずれもS9での代謝後でもnegativeというデータがあります。別にINVITROGENからなにかもらってるわけでもないので、宣伝する必要もないのですが、このような試験結果から、これはU.S. federal regulationsではhazardous wasteではないとされています。http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/Nucleic-Acid-Purification-Analysis/PDFs.Par.99865.File.dat/O-075715_SYBR_Safe_WP_flr.pdfの後ろの方に実際のデータが出てますが、安全性の試験は相当信用おけそうに感じます。 エチブロが発ガン性があるか、催奇性があるか、遺伝毒性がどの程度か、は、MSDSにまとめられています。急性毒性は事実上無視できるとして、chronic exposureでは Genotoxicity in vitro - rat - Other cell types DNA damage Genotoxicity in vitro - rat - Liver DNA damage Genotoxicity in vivo - mouse - Intraperitoneal DNA inhibition Genotoxicity in vivo - mouse - Intravenous Sister chromatid exchange Laboratory experiments have shown mutagenic effects. となっています。SigmaのMSDSをご覧ください。AMESテストだけというのは、昔の話です。どれくらいの量と時間でこうなるのかは、よくわかりませんが。なお、エチブロは、細胞膜は、染色に使えるほど、すかすか通りはしませんが、この手の正の荷電の低分子は、いつまでもほとんど透過しない硫酸基のようなのとは違って、意外と膜を透過するようです。代謝されると特にそうでしょう。 ただ、これがラボのレベルの使用でどの程度危険性があるのか、まったくわかりません。しかし、もしラボにいた学生や、実習でエチブロに間接的にでも触れた学生が、将来、お子さんを生んで、障害が現れたり、本人が癌になったりしたら、使わせた人間として責任を感じます。もちろん、絶対に証明できないことですし、エチブロがついた泳動槽を触ったくらいで、遺伝毒性が出るとも思えませんが、あまり気持ちいいものではありません。

(無題) 削除/引用 No.216-11 - 2009/03/21 (土) 19:20:35 - AP >CDRTさん >分子生物学をやってるラボでは、EtBrは大丈夫、と先輩から伝えられて、それを信じてやってきていますが、その根拠は見たことありません。APさんの言われるように確かに量としては少なくとも、それが生物に与える濃度として無視できるものなのか、さっぱりわかりません。反面、変異原性があることは昔から証明されているわけで、現に細胞膜を容易に透過するのでDNAに結合するだろう事は予想できます。 EtBrは生細胞にはほとんど取り込まれません。生細胞に取り込ませてDNAを染める目的で、わざわざ細胞膜を透化しやすく修飾したEtBrの誘導体が売られているくらいです。変異原性は他の方のリンク先（のリンク先）にあるように、肝抽出物で処理し、解毒系によって修飾させた（それによって細胞に取り込まれやすくなってしまった）EtBrを使った場合のAmes testから言われていることです。EtBrそのものはAmes testでnegativeです。 だからといっていい加減に扱って良いと言っているのではないですよ。環境中に垂れ流した場合、微生物などの代謝で細胞に取り込まれやすい誘導体が出来るともかぎらんですから。しかし、使用量や毒性の程度からいって十分コントロールできるだろうというんです。先にも書きましたが、後染めにするだけでも汚染の範囲は制限できますし、染色液だけなら適切な方法で安全に処理するのも難しくないです。生物毒性から言ったらアクリルアミドや免疫染色で使われるDAB、あるいはEDTAですら（たしか欧州では規制されていたはず）、毒性も使用量も多いと思うのですが。 アカデミズムの牙城である大学で、どれだけ学術的な検討をしてEtBrを使うなと言っているのか？というところに憤りを感じているのです。存在理由の自己否定じゃないかと。感覚的に危なそうだから遺伝子組み換え反対！と言っている人たちと同じレベルに落ちていないか？ということです。

(無題) 削除/引用 No.216-10 - 2009/03/21 (土) 19:06:50 - 一知半解 便乗質問なのですが、SYBRなんたらの発癌性や催奇性がEtBrよりも低そうだというのはどのくらい信憑性のあることなのでしょうか。 EtBrと同様にDNAにインターカレートするタイプの蛍光染色剤なので、複製エラーを誘起するという点ではそれほど差異があるようには思われません。Amesテストでスコアが低いというのは、この場合はサルモネラの薬剤排出系でEtBrよりも排出されやすいとか、そういうヒトに対する発癌性とは相関の低そうな性質で決まっているような気がするのですが。 Mupid-Stain Eyeのような核酸と静電的に相互作用するような染色剤の発癌性が低いというのはもちろんそのとおりだと思っています。ただし、残念ながらEtBr等蛍光系染色剤とは比べものにならない低感度ではありますが。

(無題) 削除/引用 No.216-9 - 2009/03/21 (土) 18:34:31 - 一知半解 AP様、 EtBrはどんなに垂れ流しにしても法令上は何の問題もないはずですので、それが原因ということもなさそうですが。 CDRT様、 分子生物学をやってるラボをいくつか渡り歩きましたが、どこでも程度の差こそあれ気をつけて使うように言われていましたよ。 それとは逆の主張をするようですが、EtBrは電解質なので細胞膜はほとんど透過しないのではないでしょうか。 EtBrの毒性については旧フォーラムでもトピックが立ちました。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=4432

(無題) 削除/引用 No.216-8 - 2009/03/21 (土) 14:23:51 - CDRT 分子生物学をやってるラボでは、EtBrは大丈夫、と先輩から伝えられて、それを信じてやってきていますが、その根拠は見たことありません。APさんの言われるように確かに量としては少なくとも、それが生物に与える濃度として無視できるものなのか、さっぱりわかりません。反面、変異原性があることは昔から証明されているわけで、現に細胞膜を容易に透過するのでDNAに結合するだろう事は予想できます。 　これは、ErBrが一番安く便利で、誰も死んでるようには見えないから（長期的にはわかりません）、「多少の」リスクの可能性は、研究を進める上ではおうべき、ということで使い続けているように思います。しかし、EtBrより変異原性がずっと少ない試薬類が出てきている現在、大学に言われなくても、研究室としては、EtBrの使い方を見直すべきと、私は考えています。 　うちのラボでは、EtBrをゲルに混ぜたり、溶液に入れたりするのはやめました。いくつか試した結果、SyberSafeをゲルに入れて使っています。これだとSyberGoldやGreenとは違って、泳動度に影響を与えませんし、また、冷蔵庫でゲルを保存すればかなり長く持ちます。室温で保存するとあまり長持ちしません。 　これでEtBrよりちょっとおちる程度の感度で見ることができますが、見えないときは、紙にEtBrが付着してあるシート（Instastain, http://www.edvotek.com/pdf/instastain_ethidium.pdf、コスモバイオ）を5分くらいのっけてから見てます。これだと、撮影場所において、紙をのっけるだけで、おわったらゲルごと捨てればいいので、流しへの汚染は起こりません。Instastainだけでも、もちろん使えますが、待つのがいやなので、こういう2段構えにしています。 　このInstatainはすぐれたアイデアですが、詰めの甘い商品で、ロール(#2005)以外のはあまり実用的でなく、ロールでも適当な大きさに切るためには、EtBr専用のはさみと、それらのものを置く場所を決めて、そのエリアにあるものには素手で触らないようにしています。 　全体として、EtBrよりコストは若干かかりますが、EtBrを使う事への精神的な負担（自分もそうですが、遺伝毒性を持つ可能性のものを、これくらいは大丈夫と言って学生に使わせる事への罪悪感）と比較すると何でもありません。SyberSafeは、泳動液に入れるのでない限りは、最小限で済みます。

(無題) 削除/引用 No.216-7 - 2009/03/20 (金) 23:16:24 - AP つい先日、組換え大腸菌、酵母の垂れ流しで半年の停職処分になった神○大学の先生の余罪がEtBrの垂れ流しだったからなあ。とばっちりかな。

(無題) 削除/引用 No.216-6 - 2009/03/20 (金) 23:08:57 - AP ああ、UV使用に関しては青色LEDを使ったイルミネーターを使えば、DNAにも実験者にも被爆による危険性は排除できます。

(無題) 削除/引用 No.216-5 - 2009/03/20 (金) 23:06:26 - AP EtBrより感度が良く、アッセイ（エイムズ試験などか？）で見る限り安全性が高い（絶対安全かどうかは保証されていないけれど）Cybr-GreenとかGelredとか、最近ではいろいろ出ていますが、長期の使い回しができないので使用量は増える（コストも高い）でしょう。安全性は想定される毒性とdoseとの兼ね合いだと思うのですが、ガイドラインを決めた人たちはどういう検討をしたんでしょうね（経緯がわかれば私も参考になりますが）。そういうこというなら、検討の結果EtBrのかわりにこれの方が望ましいというようなことを出してこそのガイドラインだと思いますが（代替品が安全かどうかは、また委員の判断になるんじゃないでしょうか？）。と、いうようなことを会議で言う筋の通った先生はいないのか。

(無題) 削除/引用 No.216-4 - 2009/03/20 (金) 22:17:23 - ~ >Mupid-blueと、Mupid-Stain Eye 高校生の体験実習や研究所の一日公開日向けの染色剤と思っていましたが。 当然書かれている染色剤の検出感度は調べていますよね。 許容範囲内なのでしょうか。 使用する酵素などが増えるでしょうから、コスト削減になるかは疑問ですが。 感度を求めるのであれば、 サイバーグリーン サイバーゴールド SYPRO RUBY SYPRO Orange などのうち、大学の規制に含まれないものを利用してはいかがでしょうか。 EtBrよりも感度はよくなるでしょう。 コストと安全性と追加する機材は調べましょう。 感度を気にしないものについてはMupid-blueなど、 感度が大事なものは蛍光にするといいのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.216-3 - 2009/03/20 (金) 21:42:57 - 旅のカラス APさん　コメントありがとうございます 危険性についての部分なのですが、実際の危険性と言うより今後の大学のガイドラインとしてEtBrが”使うことが望ましくない試薬”として、できるだけ早く使用を中止して欲しいと言われているようなのです（目を付けられていると言いますか（苦笑）先生から伝えられた会議の又聞きなのですが）。なので、できるだけ早い時期に切り替えていくことが望まれているのですが、他の染色試薬だとやはり感度は低いのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.216-2 - 2009/03/20 (金) 21:35:01 - AP 蛍光でない染色は感度の面で相当劣りますの研究目的では実用的ではないと思います。EtBrは言うほど危険な試薬ではないし、非常に大量に使うものでもないでしょう。もっと危ない試薬はいろいろあるし、化学系研究室で使われるいろいろな危険な試薬の量に比べれば鼻くそみたいなものです。年間数mgもいかないのではないでしょうか。それでも問題ですか。 たとえば、ゲルや試薬にEtBrを入れておくのではなく後染めにすれば1 ug/mL程度の染色液でも数週間位保ちます。切り出しなどコンタミを排除しなければならない場合はその都度新しい染色液を少量作って、使った後は繰り返し使用する確認用の染色液としてリサイクルすればいいです。

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