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RNAを用いる実験の器具など トピック削除
No.3906-TOPIC - 2011/01/31 (月) 12:30:01 - ribo
いつも参考にしています。
RNAを取り扱う実験上での質問があります。

RNA抽出や3'RACEなど、RNAを取り扱う際に用いるガラス器具などは
RNaseを失活させるためにDEPC処理およびオートクレーブ処理などをして使用しています。

しかし、中には上記の処理が出来なかったり(ピペットマンなど)
実験台の処理などが必要になります。

そこで、皆様はRNAを用いる実験でRNAが壊れない為にどのような操作で実験をされていますでしょうか?
市販のRNaseおよびDNaseを失活させるようなスプレーがあるのは知っているのですが、金銭的に購入は厳しいです。


何がご意見がありましたらご教授願います。
 
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16件 ( 1 〜 16 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.3906-16 - 2011/02/09 (水) 21:30:50 - AP
RNA用に特別に器具類を分けるということはしていません。
実験台、ピペットマンなどは丁寧にふき取りする、手を良く洗う(手袋なし)くらい。昔はピペットや遠心管など、強度や耐性の関係でどうしてもガラスを使わなければならないこともあって、アルカリ洗浄、200℃の乾熱滅菌などよくやっていたものですが、今ではディスポの器具で済ませることができます。

実験台やピペットマン、あるいは手などに直接RNA溶液が触れるわけでもなく、きちんと清拭してなお、剥がれ落ちたり、舞い上がったりするRNaseがあるとは、ちょっと考えにくいです。

ただ、世の中にはいろいろな人がいるので(海外では特に、ラボのワーカーのなかには教育レベルもスキルもピンからキリまであるようですし)、常識外のひどいことをするかもしれない。それがために失敗したときに責任を転嫁されないように、実験手引書やキットのマニュアルでは最大級の注意事項が並べられているんじゃないかと思っています。カップラーメンのパッケージに「やけどの危険がありますので熱湯にご注意ください」とか、電子レンジに「ネコを入れないでください」(これは都市伝説だそうですが)という注意書きがあるようなものじゃないでしょうか。

ラボの伝統で、RNA実験のときはこうしなければならないというガイドラインはいろいろあるでしょうが、実際の事例に基づいたものって、どれだけあるのでしょうか。時間や利便性や資源を犠牲にして、実効性のないことをやっているという例も、実は多いのではないでしょうか。
それをいちいち確認するための実験というのは、研究の足しにはならないので、わざわざやるひとは、まずいないと思いますが、こういう実験環境ではRNAが分解したとか、それまでRNAの分解があたりまえだったけれど、ここを改善したら解決したとか、実例をあげていただければ、非常に参考になると思いますが。

(無題) 削除/引用
No.3906-15 - 2011/02/08 (火) 14:03:49 - 名無し
抽出する時は内在性のRNaseが存在するので、全く気にしても仕方がないようにおもいます。
mRNAからのクローニング程度なら抽出後、直ぐにPCRを行いDNAを合成させます。
もし、Real Time PCRなどを行う場合はDNAの除去作業を必要とするので、上記で書いた粗精製後から注意を払うようにしてます

(無題) 削除/引用
No.3906-14 - 2011/02/03 (木) 09:52:11 - 913
自分もNo.3906-12さんと同じ理由で、あまり気にしない派です。
細胞内にあるRNaseを働かせないように注意して作業すれば、
普通の環境なら失敗はしないはずです。

(無題) 削除/引用
No.3906-13 - 2011/02/03 (木) 08:47:31 - Actias
「RNA使用中オーラを発する」
以外、水溶液はDEPC、ただし、市販品を使うときはRNA専用にして何もしない。プラスチック器具は、nuclease-freeを信じて何もしない。マスクと手袋。手袋はこまめに代える。とにかく冷やす。
以上。
実験の目的にもよりますね。

No.3906-5 の書き込みにほぼ同じですが、場所はいつもの実験台でタンパクもRNAもDNAもやっています。

(無題) 削除/引用
No.3906-12 - 2011/02/01 (火) 19:55:33 - ンンノ
分子生物学実験の黎明期には、DNaseやRNaseを自作(?)調製していたので、
それぞれの酵素を使うような実験では作業場所を分離しないと何ともならな
かったというような昔話を聞いたことはあります。

RNaseのパウダーを扱うような実験をする人が近くにいると不味いかもしれま
せんが、そうでなければ特に気にしなくてもチューブの中に周辺のものが混入
しないように操作すれば特に失敗しないと個人的には思います。

RNA抽出過程で最大のRNaseソースは試料自身でしょう。
そのことに留意して試料調製や実験操作を行えばいいんではないでしょうか。

Ambion曰く、 削除/引用
No.3906-11 - 2011/02/01 (火) 12:17:41 - アンジョリーナ・ジェリー
オートクレーブでもそれなりにRNaseが失活するらしいですよ、奥さん
http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_178.html

まあ最初からヌクレアーゼフリーを謳っているチューブやチップとかならわざわざオートクレーブしようとは思いませんが。

AmbionのサイトはRNA関連の情報が充実してておすすめです。
http://www.ambion.com/techlib/basics/rnasecontrol/index.html

(無題) 削除/引用
No.3906-10 - 2011/02/01 (火) 09:04:05 - nana
オートクレーブはRNaseを失活させないどころか、RNaseのコンタミを招く恐れがあります。買ったものを、何も手を加えず、そのままきれいに使うのが一番です。

(無題) 削除/引用
No.3906-9 - 2011/02/01 (火) 00:17:50 - nnn
皆様が書かれた中では、amiさんのに近いですかね。

チップはフィルターチップ(特に10uLチップはロングタイプ)
ピペットマンは自分用(大腸菌ワークなどとも兼用)
チューブは、気持ちオートクレーブ。
手にはディスポグローブ。(マスク、帽子は無し)

幸い、今のオープン実験台がある所は、埃も少ないので
クリーンベンチは使わなくてすみ、エタノールで拭くのみ。

試薬瓶は、試薬が50mLまでなら、ディスポのチューブ。
どうしても大量にいる場合は、乾熱滅菌した瓶を使用。
乾熱滅菌できない器具は、過酸化水素水処理。

水は、少量ならAmbionから購入したRNase-freeの水を使用。
(フィルター濾過の方。DEPCは未添加のやつ)

一時的に冷却するときは、チューブを直接氷上には置かないで、
アルミブロックなどを介す。

(無題) 削除/引用
No.3906-8 - 2011/01/31 (月) 22:11:20 - 123
チップやエッペンはDEPC処理
試薬はすべてRNA用
薬さじ、ガラス瓶など乾熱を掛けられるものはすべてかける
実験台にはアルミホイルを敷く

オートクレーブではRNaseは失活しないと習いました。

(無題) 削除/引用
No.3906-7 - 2011/01/31 (月) 17:46:07 - ami
○ピペットは普段使っている自分持ちのやつを使う
○チップはフィルターチップ使う
○場所はクリーンベンチをエタノールで軽く掃除してアルミ箔を敷いて使う、ファンはオフのまま
○ディスポの物を使う、ガラス瓶とかはできるだけ使わない

くらいの感じで、cDNA Library作ってます。

(無題) 削除/引用
No.3906-6 - 2011/01/31 (月) 15:47:30 - TS
わたしは、スプレー式のRNAse zapperとして、
0.5% SDS, 3%H2Oを作っています。

どこかで見つけたレシピだったと思います。

あまり深くは考えずに使っていますが、どうなんでしょう。
やらないよりましかな、おまじない程度かなとも考えていたり、
一方で、SDSなんかの持ち込みがあったら嫌だな、とも考えたりもしますが。

横やりで恐縮ですが、ご意見をいただけると嬉しいです。

(無題) 削除/引用
No.3906-5 - 2011/01/31 (月) 14:29:32 - ~
スプレーを買えないということで、お金の無いラボにいた時の話の方が参考になるかと思います。

1.ピペットマン、チューブ立てはRNA実験専用を用意する。(全員で共有)
2.チップはフィルター無しで、新品の袋(バラを使っていました)を用意。手袋をして、RNA実験専用のチップラックにセットしてオートクレーブ。袋の中の余ったチップはRNA実験用としてビニールテープで蓋をして保管するか、DNA実験に回す。
3.実験台はサランラップまたはアルミホイルをしく。
4.喋らないし、話しかけさせない。
5.RNA実験用の冷蔵・冷凍試薬などは、サランラップでぐるぐる巻きにしておく
6.逆に、RNaseは別の実験室でのみ扱い、メインの実験室に持ち込む前には少なくともフェノクロ等で精製してから持ってくる。
位でやっていました。
7.拭き取り等は過酸化水素水を使用。

効果があるかは分かりませんが、特徴があるのは2と6位でしょうか。


ただ、単に培養細胞からtotalRNAを取ってノーザンをするくらいであれば、普段使っているチップやピペットマンでも分解したことは無かったですけどね。

(無題) 削除/引用
No.3906-4 - 2011/01/31 (月) 13:29:04 - Boston-Pullman
もっぱらエタノールです。チップケース、ピペットマン、チューブスタンド等。同僚が話しかけてくることを想定して、「RNA実験中」立札を実験台に置きます。アルミ箔で実験スペースをカバーして、チップケースなどをおいています。

話さない、自分用の試薬を確保する、実験が終わったらピペット等を引出しに閉まって埃がかからない様に大事に扱う。

こういうトピを立てるくらいの意識がある方であれば、大丈夫だと思います。

(無題) 削除/引用
No.3906-3 - 2011/01/31 (月) 13:26:24 - スプレー使ってます
RNase awayスプレー(コスモバイオ取り扱い)3200円位を使っています。

RNA用のピペットマンは専用に購入しました。

(無題) 削除/引用
No.3906-2 - 2011/01/31 (月) 12:56:25 - Pumpkin
基本的にはガラス器具などを使わずにNuclease Freeのディスポプラスチックだけで行っています。どうしても必要なものは、DEPC処理メディウムビンとか使いますが(MOPSバッファーとか)、そんなに使わなくてもいけています。試薬の使う量がすくないので、調製済みのNuclease Free試薬を使っているということもありますが。

ピペットマンは購入してからはRNA専用にし、チップをバリアチップにすることでRNase Freeになるように心がけています。

AmbionのRNase Zapを使っていますが、実験台をふいたりするのはオマジナイ程度に考えています。それよりRNaseが混入しないような実験をすることを心がけるべきです(実験中にしゃべらないとか、色々)。

近年は昔に比べて、RNA抽出バッファーが良いものになったり、RNase Free商品が多く出回るようになったために、RNA実験の敷居は随分低くなったように感じます。

RNAを用いる実験の器具など 削除/引用
No.3906-1 - 2011/01/31 (月) 12:30:01 - ribo
いつも参考にしています。
RNAを取り扱う実験上での質問があります。

RNA抽出や3'RACEなど、RNAを取り扱う際に用いるガラス器具などは
RNaseを失活させるためにDEPC処理およびオートクレーブ処理などをして使用しています。

しかし、中には上記の処理が出来なかったり(ピペットマンなど)
実験台の処理などが必要になります。

そこで、皆様はRNAを用いる実験でRNAが壊れない為にどのような操作で実験をされていますでしょうか?
市販のRNaseおよびDNaseを失活させるようなスプレーがあるのは知っているのですが、金銭的に購入は厳しいです。


何がご意見がありましたらご教授願います。

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