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primary MEFへのtransfection トピック削除
No.3966-TOPIC - 2011/02/10 (木) 11:29:14 - Pたろー
現在、primary MEFに発現ベクターをtransfectionしようと試みています。
Invitrogen Lipofectamine2000やRoche fugeneHD等条件を振って試していますが
EGFP発現ベクターのtrangentな発現でせいぜい数%の導入効率です。
できれば20-30%以上の効率で導入したく思っていますが、
お勧めの試薬や実験条件等御意見を頂けないでしょうか。
よろしく御願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.3966-6 - 2011/02/10 (木) 21:53:29 - Pたろー
ami様、コメントありがとうございます。
使っておられるMEFはprimaryでしょうか？
Xfect、試供品をお願いして試してみたいと思います。

培養はごくごく普通のDMEMで、継代2, 3度してからtransfectionしています。
preparationもスタンダードだと思うのですが、
14.5日くらいのembryoを頭と肝臓と除いて細かくした後でトリプシン処理です。

Xfect Stemは試した事あるのですが、Clontechがいうほど効率よく無く
マウスES細胞にはLFA2000を使っています。
ES細胞へのtransfectionに関しても興味があるので
近々別にトピを立てさせていただこうかと思っています。

Xfect！！ 削除/引用
No.3966-5 - 2011/02/10 (木) 20:12:19 - ami
MEFにXfectで30%くらいはてきとうにやっても入ってます。

サンプル結構大量にもらえます。お試しを。

MEFは作り方や培養の仕方で全然増殖が違うので、その辺も検討したほうがいいです。

(無題) 削除/引用
No.3966-4 - 2011/02/10 (木) 13:21:59 - Pたろー
あっ、新しいフォーラムに投稿したつもりが・・・

2020様、情報ありがとうございます。
ウィルスやエレポでも良いのですが
現在のラボで動かしていないのでreagentで済めば一番良いのですが。
効率が良いのなら、これを機会にウィルスを導入するのも手かと思っています。

TransIT-2020は「MEF transfection』で検索すると上位に出てくるので気にはなっていましたが
未だ手を出すには至っていません。試す価値はありそうですね。
InvitrogenのサイトにLipofectamine LTXを用いたMEFへのtransfectionが載っていたので、
期待して試してみましたがMEFへのtransfectionはLFA2000やfugene HDよりもダメでした。

(無題) 削除/引用
No.3966-3 - 2011/02/10 (木) 13:01:39 - 2020
補足というか訂正というか。

もともとはLFA2000を使ってました。いくつか条件検討した結果、Opti-Memを使用し、DNA-reagent複合体の存在下で30min-1hのインキュベーションであれば、私の実験上使用に耐えることはわかりました。それ以上は、時間依存的に細胞が死んでいきます。ただそれでも質問者様と同様に導入効率は<5%でしたが。

ほんとに初代培養の細胞にベストな試薬がないものですかねぇ、、、

(無題) 削除/引用
No.3966-2 - 2011/02/10 (木) 12:42:48 - 2020
ウィルスやエレポを使わず、トランスフェクションで、という括りですよね。
MEFではありませんが、現在、human fibroblasts (< 2 years old)に対してTransIT-2020 (Mirus)を使っています。

LFA2000に比べて毒性が格段に低く（そもそもLFA2000の場合殆ど死んでしまいますが）、そのおかげで10-20%は導入出来ています。

他に数種類（Fugene6 (Roche), Lipojet, Genejet, Polyjet (signagen), TransIT-LT1 (Mirus)）を比較しましたがまぁこれが ”ベター” でした（満足は全くしてません、WBには殆ど使えませんから）。他の物はとにかく毒性が高過ぎました。トランスフェクション後、2-3日置かなくてはならない場合は特に。

MEFとの違いも大いに有ると思いますし、メーカーのデータシートを見ると、総じてMEFの方がhuman fibroblastsより導入効率が高いようですので上記、私が除外した物がもしかしたら質問者様には最適かも知れませんが、参考になれば。

また他の方の御意見も是非伺いたいです。

primary MEFへのtransfection 削除/引用
No.3966-1 - 2011/02/10 (木) 11:29:14 - Pたろー
現在、primary MEFに発現ベクターをtransfectionしようと試みています。
Invitrogen Lipofectamine2000やRoche fugeneHD等条件を振って試していますが
EGFP発現ベクターのtrangentな発現でせいぜい数%の導入効率です。
できれば20-30%以上の効率で導入したく思っていますが、
お勧めの試薬や実験条件等御意見を頂けないでしょうか。
よろしく御願いします。
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