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(無題) 削除/引用 No.1224-25 - 2009/09/24 (木) 00:53:14 - 通りすがり あー、そういえばうちの研究室のゲル保存方法は、ちょっと特殊なのを忘れてました。 普通にゲルを複数作って作り置きするなら、バッファーに浸けて保存するんで、蒸発は関係ないですね。 うちの研究室はフラスコなどで溶かして、使う分だけトレーに注いで、残った物はフラスコに入れたままにします。 使うときは再度レンジにかけて溶かすを繰り返すので、複数回レンジにかけたものや、フラスコのまま長期間放置された物はかなり水が飛んでいます。 おまけに、使っていないレーンのゲルは、カッターで切り取られてフラスコに戻すという、馬鹿みたいな節約も行っています。 上記の方法で濃くなったものに水を足して元に戻すのと、直前調製の場合でもレンジで多少は濃くなる事を見越して、レンジにかける前に少し入れます。 うちの後輩はこれでした様の「バッファーに浸しながら」は「ゲルに充分な量のバッファーをかける」と同じだと思いますよ。 ゲル全体が水没するくらいバッファーをかけて、浸した状態ということです。 こういうゲルを濡らした状態でコームを引き抜く操作って、コツとかじゃなくて、基本操作じゃないんですかね？ 濡らした状態でコームを抜くのが普通で、アガロースなんかは滅多にウェルが崩れないから、時間と手間を節約するコツとして省くと言うだけだと思っているんですが…

(無題) 削除/引用 No.1224-24 - 2009/09/23 (水) 11:50:10 - もんきち 通りすがり様 コメントありがとうございます。 > 直前調整と言うのは、蒸発等で濃度が怪しいからです。 　この蒸発とは何の蒸発でしょうか？ゲル中の水分が蒸発するのですか？それともゲルを作るためのバッファーの蒸発でしょうか？ 　当方ではゲルをバッファーに入れてタッパーに保存しているのですが、この保存法では蒸発する可能性がありますでしょうか？ > 自分はレンジにかけてゲル(バッファー)が濃くなるのが気に入らないんで、ゲル調製時に水(蒸発分で1ml位?)も入れています。 　レンジで濃くなったものを水を足して希釈するというのは今まで聞いたことがありませんでした。参考にさせていただきます。 　 > バッファーをかけて抜くのは、ウェルの崩れが目視でわかりにくくなるので、あえてやらない場合もあります。 > しっかりとしたゲルが出来ていれば、バッファーをかけなくても全然問題ないです。 > 怪しいゲルや本気じゃないときはかけずに抜いて、目視です。 　本気の際はバッファーをかけていらっしゃるのですね。これはゲルを崩さないようにするためのコツのようなので勉強させていただきます。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1224-23 - 2009/09/23 (水) 11:43:10 - もんきち >[Re:20] うちの後輩はこれでしたさんは書きました : > もんきち様 > > 既に通りすがり様のおかげで解決済みの問題と思いますが、コームは泳動Bufferに浸した状態で抜いてます。 > > それと蛇足になりますが、シャープで美しいバンドの為には薄いゲルが必須、というのが私の持論ですが、他の方はどうでしょうね？いや、そんなことはない、厚いゲルでも奇麗な泳動の図が出来る、という方いますか？ うちの後輩はこれでした様 コメントありがとうございます。 　当研究室の備品では、泳動バッファーに浸しながらコームを抜くのは難しいので、バッファーをかけてから抜くようにしたいと思います。 　かつての師匠が厚めのゲルの方がたくさんアプライできて、好きだ。という持論の方でしたので、ゲルは厚いものの方が良いのだと認識しておりました。 ゲルの厚みを軽視していたように思えますので、今後適切なゲルの厚みを検討させていただきます。 ご指導ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1224-22 - 2009/09/23 (水) 00:58:48 - 通りすがり 自分は普通の厚さです。 あまり薄くすると、表面張力とかでゲルの厚さが場所によって変わるのと、ウェルやゲル上部からサンプルが出てきちゃったりするんで、余裕を持ってアプライできる程度の厚さです。 薄さを追求したりはしないです。

(無題) 削除/引用 No.1224-21 - 2009/09/23 (水) 00:46:13 - 通りすがり 直前調整と言うのは、蒸発等で濃度が怪しいからです。 何回もレンジで溶かしていると、かなり濃くなっているはずですしね。 アガロースが変性するとかそういったことは考えてないです。 溶かすのはそんなに神経質にならなくていいと思いますよ。 レンジに何回かかけて溶かしていると思いますが、しっかりと混ぜながら溶かして、溶けたと思ってから更に1,2回レンジにかける程度で充分です。 フラスコをしっかり見れば、溶けているかどうかはちゃんとわかります。 ちゃんと溶かせてない後輩や過去の自分は、それが分かっていませんでした。 自分はレンジにかけてゲル(バッファー)が濃くなるのが気に入らないんで、ゲル調製時に水(蒸発分で1ml位?)も入れています。 バッファーをかけて抜くのは、ウェルの崩れが目視でわかりにくくなるので、あえてやらない場合もあります。 しっかりとしたゲルが出来ていれば、バッファーをかけなくても全然問題ないです。 怪しいゲルや本気じゃないときはかけずに抜いて、目視です。

泳動Bufferに浸した状態で抜きます 削除/引用 No.1224-20 - 2009/09/23 (水) 00:36:06 - うちの後輩はこれでした もんきち様 既に通りすがり様のおかげで解決済みの問題と思いますが、コームは泳動Bufferに浸した状態で抜いてます。 それと蛇足になりますが、シャープで美しいバンドの為には薄いゲルが必須、というのが私の持論ですが、他の方はどうでしょうね？いや、そんなことはない、厚いゲルでも奇麗な泳動の図が出来る、という方いますか？

(無題) 削除/引用 No.1224-19 - 2009/09/22 (火) 22:30:49 - もんきち > 自分が本気で作る場合は、 > ・ゲルを直前調整 > ・レンジでしっかりと溶かす > ・適当に冷ましてよく混ぜてからトレーに注ぐ > ・トレーが少しでも曲がっているようなら、コームに紙等を挟んで、極わずかに底上げする > ・冷蔵庫で充分な時間をかけて、しっかりと固める > ・ゲルにバッファーをかけて、ゆっくりと垂直に引き抜く > ・横と上からよく観察して、ウェルが綺麗か目視 > > 大切なサンプルを流すときは、後輩には絶対作らせません。 通りすがり様 コメントありがとうございます。 とても参考になる指標をありがとうございます。 やはりこだわる人はゲルは直前調製なのですね。 コームの抜き方が驚きでした。これまで乾いたら丁寧に抜く程度であったので、泳動バッファーをかけてから抜くというのは初耳です。今後はぜひとも参考にさせていただきたいと思います。また、冷蔵庫で時間をかけて冷やすというのも初耳でした。これまで常に常温放置で固めていたので、これも参考にさせていただきたいと思います。 レンジでしっかりと溶かすは師匠も教えてくれた項目なので、これからさらに入念に溶かすよう心がけたいと思います。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1224-18 - 2009/09/22 (火) 21:28:15 - 通りすがり 自分にも似たような経験がありますね。 ゲルの作成を後輩に頼んで、そいつで流すと汚かったとか、アプライするときによく見ると底から漏れていたとか。 他人にゲルを作って貰う場合は、なるべく自分で抜いて、ウェルも目視で確認しますね。 ウェルが崩れる原因は、殆どがちゃんと冷えていないためでした。 荒々しく抜いてもそんなに崩れる事はないんですが、これにちゃんと固まっていない状態だとかなりの割合で崩れます。 あと、トレーが曲がっていて、元から底が薄い場合なども崩れやすいです。 自分が本気で作る場合は、 ・ゲルを直前調整 ・レンジでしっかりと溶かす ・適当に冷ましてよく混ぜてからトレーに注ぐ ・トレーが少しでも曲がっているようなら、コームに紙等を挟んで、極わずかに底上げする ・冷蔵庫で充分な時間をかけて、しっかりと固める ・ゲルにバッファーをかけて、ゆっくりと垂直に引き抜く ・横と上からよく観察して、ウェルが綺麗か目視 大切なサンプルを流すときは、後輩には絶対作らせません。

(無題) 削除/引用 No.1224-17 - 2009/09/22 (火) 20:56:19 - もんきち >[Re:16] うちの後輩はこれでしたさんは書きました : > ゲル作成で、泳動Bufferに浸した状態でコームを抜いていますか？うちの後輩の泳動が汚い理由がこれでした。ある日、かなり荒々しくコームを抜いたからか、DNAサンプルがウェルの底にできた穴から漏れていたので気づいたんですが。 うちの後輩はこれでした様 コメントありがとうございます。 当方では泳動バッファーには浸さずにコームを抜いています。 すいません。文脈からコームを抜くときには泳動バッファーにつけるべきなのか、つけないべきなのかが読み取れませんでした。おっしゃっている内容は、コームをどのような条件で抜くと言うことなのでしょうか？ よろしかったらご教授ください。 よろしくお願い申し上げます。 ちなみに師匠も私も固めた後のゲルからコームを抜く際は、泳動バッファーには浸さず、ゲルを固める板の上でそのまま垂直に丁寧に引き抜くようにしております。

私も「ゲルの作り方」に一票 削除/引用 No.1224-16 - 2009/09/22 (火) 20:28:21 - うちの後輩はこれでした ゲル作成で、泳動Bufferに浸した状態でコームを抜いていますか？うちの後輩の泳動が汚い理由がこれでした。ある日、かなり荒々しくコームを抜いたからか、DNAサンプルがウェルの底にできた穴から漏れていたので気づいたんですが。

(無題) 削除/引用 No.1224-15 - 2009/09/22 (火) 19:24:27 - もんきち >[Re:12] orzさんは書きました : > ゲルの作り方が悪いに1票。 > 師匠とゲルを取り替えてもスメるかやってみるといいかもしれません。 orz様 コメントありがとうございます。 ゲルの作り方は大きな違いはなかったように見えたのですが、もう一度確認してみたいと思います。 今日は師匠が来ていないので、ゲルを分けてもらうことができないのですが、次に会ったときに相談してみたいと思います。 一つお伺いしたいのですが、TBEバッファーをアガロースで固めたゲルをTBEバッファーを満たしたタッパーで保存しているのですが、この保存によって泳動パターンに影響は見られるのでしょうか？師匠はなるべくできてすぐのものを使用している（もちろん保存したものを使用することもあるようですが）らしいのですが。。。 以上よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1224-14 - 2009/09/22 (火) 19:20:42 - もんきち >[Re:11] おおさんは書きました : > >[Re:4] もんきちさんは書きました : > > > > > 師匠は丁寧に作業すればきれいに流れると教えてくれたのですが、 > > ま、漠然ですが的を得てますね。 > > サンプルの量、ゲルの厚さ、流す時の電圧とか > ゲルを作った時のバッファーが昔のもので > えいどうそうのバッファーと若干違うとか、 > えいどうそうのバッファーが使いまわしなら > どれだけ古いかとか、ゲルのできとか、、、 > どうやってエチブロとかでそめてるかとか、、 > > どんな風にスメアーひきますでしょうか? おお様 コメントありがとうございます。 サンプルの量は比較したことがないので現時点ではお答えできないのですが、 ･電圧は師匠は自分よりも低い電圧で長時間流しているそうなので、今度それを真似てみようと思っています。 ･ゲル作成時のバッファーですが、先日私が新しく調製し、それを使用して師匠がゲルを作成し、今回の泳動に用いたので、バッファーは同一のものと考えております。 ･泳動バッファーの使い回しの程度ですが、下記にも示したように師匠は特別に毎回交換するなどの処理はしていないそうです。 ･ゲルのできについてですが、作り方を初めから見せてもらったのですが、大きな差はないように見受けられました。 ･エチジウムブロマイドで染めているのですが、当研究室では泳動バッファーにエチブロを加えてある先染めの方式を取っていますので、染め方に違いはないものと考えております。ただし、適宜追加となっていますので、その濃度が問題かとは考えましたが、師匠は頻繁には添加していないようで、私もエチブロを添加しないで流してみましたがスメアは解決しませんでした。 スメアについてですが、スマイリングを若干していて、さらに一本一本のバンドがブロードになってしまうようになってしまいます。これに対して師匠が泳動したものは一本一本のバンドが垂直で、細いバンドとなっていました。

(無題) 削除/引用 No.1224-13 - 2009/09/22 (火) 19:11:03 - もんきち >[Re:10] atsさんは書きました : > sample buffer と泳動bufferは、師匠と同じものですか？ ats様 コメントをありがとうございます。 sample bufferとはローディングダイのことをおっしゃっているのでしょうか？だとすれば、sample bufferは師匠は個人管理（引き出しに隠してある）違うものを使用しておりました。 私もそこを疑ったのですが、マーカーは同じものを使用しており、このマーカーは師匠と完全に共通のものを使用しており、このマーカーも私が泳動するとスメってしましましたので、サンプルバッファーは候補から外しました。 泳動槽は師匠と共有のものを使用しており、師匠は泳動bufferを特別に新しくするなどのことはせず、そのまま（前の人が使用したまま）のものを使用しておりましたので、これもまた候補から外しました。

(無題) 削除/引用 No.1224-12 - 2009/09/22 (火) 19:05:33 - orz ゲルの作り方が悪いに1票。 師匠とゲルを取り替えてもスメるかやってみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1224-11 - 2009/09/22 (火) 00:49:34 - おお >[Re:4] もんきちさんは書きました : > > 師匠は丁寧に作業すればきれいに流れると教えてくれたのですが、 ま、漠然ですが的を得てますね。 サンプルの量、ゲルの厚さ、流す時の電圧とか ゲルを作った時のバッファーが昔のもので えいどうそうのバッファーと若干違うとか、 えいどうそうのバッファーが使いまわしなら どれだけ古いかとか、ゲルのできとか、、、 どうやってエチブロとかでそめてるかとか、、 どんな風にスメアーひきますでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1224-10 - 2009/09/21 (月) 16:48:48 - ats sample buffer と泳動bufferは、師匠と同じものですか？

(無題) 削除/引用 No.1224-9 - 2009/09/21 (月) 11:18:43 - もんきち >[Re:7] うさんは書きました : > ここで、「〜こうしたら」ってアドバイスがでても、 > それは質問者様の解決法ではなく、違うプロトコールってだけです。 > > 実際に見てくれる師匠がいるのならば、それを十分に活用するべきです。 う様 ご指導ありがとうございます。 もう一度自分の操作を見直しながら、検討をしてみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1224-8 - 2009/09/21 (月) 11:15:27 - もんきち >[Re:6] !さんは書きました : > 師匠との違いを、目を皿にしてもう一度１２０％の集中力で見つける努力。 > > こういうことは実際に教えてくれる人から教えてもらうこと以外上達はあり得ない。 > 恥を忍んで、手間をかけさせて悪いという気持ちを師匠に伝えながら教えてもらうことです。 > > ここに質問して、逃げるようではだめ。 ！様 わかりました。 師匠に頼み込んでもう一度リトライいたします。 貴重なお言葉ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1224-7 - 2009/09/21 (月) 10:24:02 - う ここで、「〜こうしたら」ってアドバイスがでても、 それは質問者様の解決法ではなく、違うプロトコールってだけです。 実際に見てくれる師匠がいるのならば、それを十分に活用するべきです。

(無題) 削除/引用 No.1224-6 - 2009/09/21 (月) 10:14:51 - ! 師匠との違いを、目を皿にしてもう一度１２０％の集中力で見つける努力。 こういうことは実際に教えてくれる人から教えてもらうこと以外上達はあり得ない。 恥を忍んで、手間をかけさせて悪いという気持ちを師匠に伝えながら教えてもらうことです。 ここに質問して、逃げるようではだめ。

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