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クローニングがうまくいきません。 削除/引用 No.4466-15 - 2007/07/03 (火) 19:17:16 - lodish 酒多飲さん、APEさん、ありがとうございます。 CIAP処理の後は、TEを加えて中性にして、フェノール抽出、エタ沈しています。 その後、ライゲーションからやり直した結果、一つだけ目的のインサートが入っていると思われるものを得ることができました。現在、シーケンスの段階です。一応解決ということにしましたが、今後、クローニング成功率を高めるため、皆さんのアドバイスを参考にしたいと思います。 私にアドバイスを下さった方、ありがとうございます。

謹んでお詫び申し上げます 削除/引用 No.4466-14 - 2007/07/03 (火) 16:13:26 - 酒多飲 bp さんのおっしゃるとおりですね。 このフォーラムの趣旨からすれば、 問題解決になる情報を示すべきであって、 ｢こんなのでも大丈夫だよ｣というのは よほど確実なものでない限りは出すべきではなかったと 反省しております。

(無題) 削除/引用 No.4466-13 - 2007/07/03 (火) 12:44:49 - bp 酒多飲さんの挙げておられる表は、bpと表示されている部分にcohesive endのssDNA部分は含まれていないし、％表示は定義量の10倍加えた時にどれくらい切れるかを表したものなので、これをもってPCR産物が”問題なく”切れるとするのはちょっと抵抗があります。

念のため 削除/引用 No.4466-12 - 2007/07/03 (火) 12:09:44 - 酒多飲 CIAP の失活はどのようにしておられますか？ あと D さんご指摘のオリゴじゃない方のやつは 同じく NEB にありますね。 http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_linearized_vector.asp

(無題) 削除/引用 No.4466-11 - 2007/07/03 (火) 11:52:46 - APE PCR反応後の産物は、ゲル抽出して、その後制限酵素処理、キットで精製を行っています。キットはMinElute reaction cleanup kitを使用しています。TAKARAのpyrobestは回収率が非常に悪くなりますが、その他の会社のものでは回収率は実用レベルです。自分はCIAPやBAPではなくSAPを使用しています。制限酵素処理の最後に加えるだけで効果が認められます。あとはだまされたと思って、UV照射せずにDNA断片を切り出してみて下さい。自分はこれだけで相当改善されました。いそがばまわれ、で、最終的には時間の短縮になると思います。

クローニングがうまくいきません。 削除/引用 No.4466-10 - 2007/06/29 (金) 12:07:37 - lodish Dさん、ありがとうございます。 制限酵素とリガーゼを用いたクローニングは始めたばかりです。以前は別のクローニング法でやってました。 今は、制限酵素処理、もしくはライゲーションが不十分だったのかなと思っています。実験は続行中ですが、まだ、解決していません。 一度、別のDNA断片（500bp）を制限酵素とリガーゼを用いたクローニング法でクローニングしたことはあるのですが、インサートが入っている率は低かったです。

(無題) 削除/引用 No.4466-9 - 2007/06/29 (金) 01:54:24 - D 足場はccgとか3bpで十分ですよ 少なくともHindIIIとXhoIは自分が切ってますから問題なしです リンクされてるNEBのやつは自分のラボの冷凍庫にも貼ってあって勘違いしている人が多いですが、あれはとても短いオリゴの時の話で、PCRをかけるような長さのものであれば3bpで十分のようです 少なくともMajorな酵素は全部平気です PCR後もエタ沈していればたいてい大丈夫です 自分はKOD plusを使っていますが 問題が起こったことはありません 今はPCR purification kitが楽なのでエタ沈しなくなりましたが 以前はエタ沈で30遺伝子以上クローニングしてました lodishさんは以前にクローニングした経験はないのかな？ インサートのない空ばかりが出来ているようですから CIAP処理を最適化するorBAPとかに変える(なぜかBAPじゃないと上手くいかないこともある？) DNA切断量を絞る(多すぎは良くない、特にvector側→Self ligation↑) 酵素処理時間はちょっと長めにする(但しovernightは避ける、酵素適量で3hぐらい) そういえばTAKARAの酵素を使っているならHindIIIとXhoIはK bufferが良いですよ HindIIIは200 XhoIは160 ぐらいの活性になるって書いてありましたっけ あとCIAPやBAPもカタログできちんと調べると、どういう条件の方が良いか詳しく書いてあります Trisは結構濃いほうが良くて、温度はCIAPが55℃、BAPが65℃だったかな？ 500bpのクローニングなら難しくないと思いますので頑張ってください

(無題) 削除/引用 No.4466-8 - 2007/06/29 (金) 01:17:16 - A 私もPCR断片を制限酵素処理してクローニングしようとして、 トラブルになったことがあります。特にPCR断片は制限酵素 処理が上手くいっていてもいなくても確認できません。 足場が足りないかもしれない場合や制限酵素処理が上手く いっていないかもしれない場合は目的の断片をTAクローニング して、ついでに配列を確認した上で制限酵素処理するのが 確実です。私はこの方法でトラブルシューティングしました。

クローニングがうまくいきません。 削除/引用 No.4466-7 - 2007/06/27 (水) 11:54:16 - lodish Harveyさん、ありがとうございます。 確かに足場3bpでは不十分かもしれません。 あと、誤解させてしまったようで、すいません。フェノール抽出はしていません。この実験の経験が少ないので、経験豊富なHarveyさんのような方にいろいろ注意する点などを教えていただきたいと思いまして。

(無題) 削除/引用 No.4466-6 - 2007/06/27 (水) 11:20:46 - Harvey フェノール抽出はしておられたようですね。 先ほどは忘れていましたが、HindIIIもXhoIも足場3bpでは不十分かも知れません。 http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_olignucleotides.asp

クローニングがうまくいきません。 削除/引用 No.4466-5 - 2007/06/27 (水) 11:12:54 - lodish Harveyさん、ありがとうございます。 PCR産物をクローニングする際は、フェノール抽出してから制限酵素処理を行なうべきということですね。勉強になりました。 他の原因は考えられないでしょうか？ぜひ、力を貸してください。

(無題) 削除/引用 No.4466-4 - 2007/06/27 (水) 11:06:11 - Harvey それは危ないです。PCR酵素も除かれていませんし、エタノール沈殿をNaClやNaOAc等の塩で行うと、dNTPsもかなり夾雑してきます。 エタノール沈殿の前にフェノール抽出等でPCR酵素を十分に除く必要があると思います。フェノール抽出ではPCR酵素は失活しないと言う人までいますが、実用上はこれで十分です。

クローニングがうまくいきません。 削除/引用 No.4466-3 - 2007/06/27 (水) 11:01:00 - lodish Harveyさん、ありがとうございます。 そのようなことがあるんですか？知りませんでした。 PCR産物はエタ沈後に制限酵素処理を行ったんですが、これでは問題解決できませんか？

(無題) 削除/引用 No.4466-2 - 2007/06/27 (水) 10:38:07 - Harvey PCR酵素の持ち込みで制限酵素反応中に断端がfill-inもしくはdeletionされているとか？

クローニングがうまくいきません。 削除/引用 No.4466-1 - 2007/06/27 (水) 10:14:20 - lodish クローニングしたいものは、PCRして末端にそれぞれ制限酵素サイトHind�VとXho�T（足場は3bp）を付加した500bpのDNA断片です。制限酵素処理して電気泳動後に、精製しています。一方、ベクターはpGEM7で、こちらもHind�VとXho�T処理して、CIAP処理しています。 これらをライゲーションして大腸菌DH5αに形質転換しました。コロニーは生えてくるのですが、得られたプラスミドを電気泳動でコントロール（pGEM7）と比較した結果、インサートが入ったプラスミドがありませんでした（24個中0個）。 原因がわかりません。なにか考えられることがありましたら、何でもいいので教えてください。

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