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(無題) 削除/引用 No.4309-4 - 2007/05/31 (木) 08:48:18 - 〜 私がいたところでは、 ハイブリバッグにプローブを入れたときから、 ハイブリの温度を維持するように気をつけています。 具体的には、プレハイブリしたバッグに速やかにプローブを入れて、 すぐにオーブンに戻しています。 一回温度が下がって結合すると、なかなか剥がれないといわれましたが、真偽は不明です。 washの温度や時間の条件も大丈夫でしょうか。 人によっては、室温のバッファーを入れてオーブンにいれたり、 あらかじめ温めておいたバッファーでwashしたりします。

(無題) 削除/引用 No.4309-3 - 2007/05/30 (水) 23:43:44 - サザン ＞〜さん さっそくのお返事ありがとうございます。 目的の種ではその遺伝子は単離されておらず、 またゲノム等もほとんど解析されて いないため、相同性がどのくらいあるのかは全く分からない状況です。 プローブとして用いている配列は、ブラスト検索とマウスとの配列比較から、Aluなどのリピート配列ではなく、目的としている遺伝子であることは確認しています。 実験条件なのですが、以前はきちんとシグナルが観察された条件で、そのときに用いたプローブを使って実験しました。対象にしたDNAも同じもので、処理した制限酵素も同じです。しかし今回は何度やってもレーン全体から強くシグナルがでるようになってしまったのです… ハイブリの温度は50度でやっていますが、5度ずつ上げてみようかとも思います。アドバイスありがとうございます。 私の研究室ではサザンを経験している人が多く、同じプロトコールを使って皆きちんと実験を成功させていました。私だけが今回のような状況に陥ってしまっています。また、このような状況に陥った人は周りにいないようです。 同じDNAとプローブを使っていても、このように実験結果がおかしくなる ことにはハイブリの温度以外に何か原因はあるのでしょうか？単に私の実験技術が未熟なだけでしょうか…

(無題) 削除/引用 No.4309-2 - 2007/05/30 (水) 22:33:29 - 〜 その配列で、目的の種のゲノムとの相同性を調べたときにはどのような結果になっているのでしょうか。 Alu配列を含む配列でプローブを作ると、ヒトゲノムでのサザンはレーン全体に渡って結合したことがあります。 ハイブリ温度を5度くらいずつ上げていってみてはいかがでしょうか。

サザンブロットでのトラブルの解決方法について 削除/引用 No.4309-1 - 2007/05/30 (水) 19:41:57 - サザン はじめまして。 現在サザン解析をしています。 マウスcDNAからクローニングしたシングルコピー遺伝子をPCR法によってラベリングし、これをプローブとして、別種のゲノムDNAにハイブリダイズさせ、その遺伝子の有無を確認しようとしています。 しかし、ハイブリ後にCDP-Starを用いて化学発行させ現像すると、DNAを流したレーン全体からかなり強いシグナルが観察されるようになってしまいました。制限酵素による差はほとんどなく、DNA全体が非特異的にプローブと結合してしまっているように思います。以前使ってうまくいっているメンブレン、プローブを用いても同様の結果しかでません。試薬等も作り直して実験してみたのですが、結果が変わりません。 もし解決方法が分かる方がいらっしゃいましたら、ぜひ教えていただきたいです。

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