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(無題) 削除/引用 No.4621-3 - 2007/07/27 (金) 01:08:42 - Ｔ デザインとしては特に問題ない方法だと思います。ただし、全てのステップが充分効率が高いというのが前提です。少なくとも空ベクターやセルフライゲーションが出ることから、ベクターの切断や脱リン酸化が不完全なのが分かりますね。 私なら (1) insert A : KpnI cut → 塩を足して BglII cut → 4dNTP と Klenow を足して BglII のみ fill-in (2) insert B : KpnI cut → 4dNTP と T4Pol を足して blunting → 熱失活 → 塩を足して BglII cut (3) vector : KpnI cut → 塩を足して BglII cut → SAP を加えて脱リン酸化 でフラグメントを調整し、(1)(2)(3)全てをゲル抜きしてライゲーションに使います。まあこのあたりは人によって色々な手順があり得ると思います。しかし空ベクターのコロニーはせいぜい数個に抑えるべきでしょう。 しかし、そもそも３フラグメントライゲーションを選択する意味は、多少多めにクローンを拾えば一発で目的のコンストラクトができるというスピードにあります。何度も実験を繰り返し、その度に多数のクローンをチェックするのでは時間も手間もかかって何のメリットもありません。一度試してうまく行かなければ、 PCR で繋ぐか別のコンストラクト法を検討する（例えば insert A, B を別々にベクターの KpnI-BglII に入れておいてから繋ぎ直す）方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4621-2 - 2007/07/27 (金) 00:25:27 - 奴隷 そのくらいまでのことであればルーチンでやってます。確かに効率は良くないかもしれませんが、12クローンも拾えば幾つか当たりが取れるだろうというのが実感です。 コツというほどのものかどうか分かりませんが、３ピースのモル数を揃えた方が効率が良いと思います。また、ハズレクローンのほとんどがセルフライゲーションならば、ベクターの消化を念入りにやるべきでしょうね。２つの酵素の切る順序が効く場合もあります。この場合はBglIIがendに近いと切れにくいようですので、先にBglIIで消化して切断を確認した後にKpnIで消化する方が良いと思います。 それからこれは誉められたものではないのかもしれませんが、私はbluntingは制限酵素消化の反応液に4xdNTPsとKlenow（or T4 DPase）をそのまま入れて反応し、そのままゲルに掛けて切り出しています。手数を少なくするとトラブルの入り込む余地が少なくなるかなと思うので。

平滑末端を含む3フラグメントのクローニング 削除/引用 No.4621-1 - 2007/07/26 (木) 21:39:03 - りり 三フラグメントのクローニングでてこずっているので ご教授下さい。 KpnI KpnI （BglII）（KpnI）　 BglII BglII ----| |--------| 　|---------| 　|----- vector　insertＡ　insertＢ　vector このようなプラスミドを作ろうとしております。 （）内のサイトは平滑でKillします。 これを作るのに、 �@インサートAをBglII、インサートBをKpnIでそれぞれ別々に消化 �A熱失活＆EtOHppt �Bこれらのフラグメントを平滑化処理 �AEtOHppt �CインサートAをKpnIで、インサートBをBglIIで消化 �D電気泳動→バンド切り出し �E予め脱リン酸化（37℃30分、65℃15分）しておいたベクターアームと 16℃、overnight �FLigation産物をJM109に形質転換 このような事をやってみました。 コロニーは出るのですが（50個以下）、セルフライゲーションか ベクターアームの切れ残りのバックグラウンドだと思われ、 現時点でインサートがありません。 この方法は効率が悪いというのは承知しておりますが、 もし殆ど不可能であれば、諦めて他の方法を捜したいと思います。 このようなクローニングを成功させられた方がいらっしゃいましたら、 コツなどをお教えいただければと思います。 よろしくお願いいたします。

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