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マウスサザンブトット；gDNA量, Fragmentation トピック削除
No.55-TOPIC - 2011/02/21 (月) 23:14:47 - サザン
いつもお世話になっています。
マウスES細胞のgenotypingをSouthern blottingで行なっていますが、皆様のアドバイスを頂きたいです。ある制限酵素で処理後に、targeting前のwilde typeのゲノムでは11kbに、mutantでは11kbと3kb (ヘテロ）にバンドが出ると予想されます。同じプローブで11kbと3kbが検出されます。なので3kbにバンドがでたクローンをpositive cloneと判断しようと思っています。サザンブロットするといくつかのクローンで3kbのバンドを確認できたのですが、11kbのバンドが(wild type, mutant共に）検出されませんでした。恐らく大きなサイズのgDNAのtransferが十分でないためではないかと思っています。

質問01
大きなフラグメントを検出する際に改良する点を教えて頂けないでしょうか？11kbくらいのサザンは論文を見るとそれほど珍しくないようですが、なんせ初心者なもので。ちなみに電気泳動後のゲルは0.2 M HClで約30 min程度処理しています（Blue Dyeが黄色になるまで）。

質問02
泳動するgDNAの量は一般的にどのくら必要ですか？現在は10 µgのgDNAを流していますが、同僚は15 µgだそうです。検出系は32Pラベルされたプローブを使っています。

アドバイス宜しくお願い致します。
　
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