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リアルタイムPCRによる多種細胞間の発現量の比較 トピック削除
No.1259-TOPIC - 2011/11/27 (日) 21:32:30 - ssbb
リアルタイムPCRを使って培養細胞4つ（A,B,C,Dとする）の間で3つの遺伝子（X,Y,Zとする）の発現量を比較したいと思っています。
比較の方法は内部標準のtubulinで割った相対定量を考えています。

方法は培養細胞からRNAを回収し、2.5μgのRNA量になるように調整して逆転写しcDNAを合成します。
リアルタイムPCRにはSYBR Greenを使う予定です。

本題ですが、検量線を作成して定量を行いたいのですがその方法に悩んでいます。
@目的配列を含んだプラスミドをつかった検量線をそれぞれ作成し、4つの細胞で使う
検量線は遺伝子X,Y,Zと内部標準のtubulinの計4つ作成する

AA〜DのどれかのcDNAから各遺伝子の検量線を作成し、4つの細胞に使う
検量線は遺伝子X,Y,Zと内部標準のtubulinの計4つ作成する

BA〜DそれぞれX,Y,Zの検量線を作成する。
検量線は各培養細胞につきX,Y,Z,tubulinの4つずつ、計16コ作成する。

これらの方法を考え、@のプラスミドを使った検量線を使って定量を行いたいと思ったのですが定量方法として正しいのでしょうか。
先生からはプラスミドとcDNAではPCR効率が違うからAかBのが正しいのではと言われています。
　
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(無題) 削除/引用
No.1259-4 - 2011/11/29 (火) 13:55:33 - xyz
いい先生と先輩がおられるようですね。

> 定量結果がxはA,Bでは同程度の発現量に対しC,Dではその半分以下、yはBで一番高くそれ以外は1/10以下、zはいずれの細胞でも同程度だった。
> 全ての細胞、遺伝子ではBのyが一番高く発現していた。
>
> と、多数の培養細胞、多数の遺伝子間で発現量を比較しても大丈夫なのでしょうか。


相対定量では、
> 定量結果がxはA,Bでは同程度の発現量に対しC,Dではその半分以下、yはBで一番高くそれ以外は1/10以下、zはいずれの細胞でも同程度だった。
までを言う事が出来ます。

> 全ての細胞、遺伝子ではBのyが一番高く発現していた。
を証明したい場合は、絶対定量を行う必要があります。



つい最近のトピも参考になると思います。
http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2011/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1189

リアルタイムPCRによる多種細胞間の発現量の比較 削除/引用
No.1259-3 - 2011/11/29 (火) 12:58:30 - ssbb
xyzさん
発現量の高い培養細胞のcDNAを使って検量線を作って定量を行なってみます。


追加でお聞きしたいのですが、
xの検量線を細胞Aから、yの検量線を細胞Bから、zの検量線を細胞Cから作成したと仮定します。
定量結果がxはA,Bでは同程度の発現量に対しC,Dではその半分以下、yはBで一番高くそれ以外は1/10以下、zはいずれの細胞でも同程度だった。
全ての細胞、遺伝子ではBのyが一番高く発現していた。

と、多数の培養細胞、多数の遺伝子間で発現量を比較しても大丈夫なのでしょうか。

先輩には遺伝子が違ったらプライマー効率も違ってくるから比較はできないと言われたのですが、自分としては検量線のスロープが各遺伝子で近ければ問題ないと思っているのですがどうなのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.1259-2 - 2011/11/28 (月) 08:02:52 - xyz
相対定量なら、２の方法で
解析する４つの細胞のなかで、一番発現量が高い（と思われる）細胞を、
解析遺伝子ごとにそれぞれ使い、段階希釈による検量線を作成して、
PCRの増幅効率と定量性のある範囲を求めます。

場合によっては、遺伝子Xの検量線は、細胞Aで、
遺伝子Yの検量線は細胞Bで、となることもあります。
相対定量用の増幅効率と定量性のある範囲は、
一度確かめると、理論上、同じRT試薬を使い、同じqPCR条件ならば、
各PCRごとに検量線を書かなくても大丈夫です。


絶対定量を行う場合は、
２の方法で、PCRの増幅効率と定量性のある範囲を確認したうえで、
その条件で、１のプラスミドによる検量線を作成して、
細胞のRNAからRTを行ったcDNAサンプルと、精製されたプラスミドを用いた場合で、
PCRの増幅効率が変わらないことを確かめて、実験を行います。
絶対定量の場合は、各PCRごとに検量線を書く必要がでてきます。


余談ですが、
内部標準にする遺伝子を何にするかというのも
結構重要なポイントになってきます。

リアルタイムPCRによる多種細胞間の発現量の比較 削除/引用
No.1259-1 - 2011/11/27 (日) 21:32:30 - ssbb
リアルタイムPCRを使って培養細胞4つ（A,B,C,Dとする）の間で3つの遺伝子（X,Y,Zとする）の発現量を比較したいと思っています。
比較の方法は内部標準のtubulinで割った相対定量を考えています。

方法は培養細胞からRNAを回収し、2.5μgのRNA量になるように調整して逆転写しcDNAを合成します。
リアルタイムPCRにはSYBR Greenを使う予定です。

本題ですが、検量線を作成して定量を行いたいのですがその方法に悩んでいます。
@目的配列を含んだプラスミドをつかった検量線をそれぞれ作成し、4つの細胞で使う
検量線は遺伝子X,Y,Zと内部標準のtubulinの計4つ作成する

AA〜DのどれかのcDNAから各遺伝子の検量線を作成し、4つの細胞に使う
検量線は遺伝子X,Y,Zと内部標準のtubulinの計4つ作成する

BA〜DそれぞれX,Y,Zの検量線を作成する。
検量線は各培養細胞につきX,Y,Z,tubulinの4つずつ、計16コ作成する。

これらの方法を考え、@のプラスミドを使った検量線を使って定量を行いたいと思ったのですが定量方法として正しいのでしょうか。
先生からはプラスミドとcDNAではPCR効率が違うからAかBのが正しいのではと言われています。
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