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(無題) 削除/引用 No.1373-15 - 2012/01/03 (火) 00:13:52 - 酵母 SS様 ありがとうございます。 候補の絞り込み基準、大変参考になります。 すべてシークエンスできればよいのですが、Bossの許しが出ないので、 今後の参考にさせていただきます。 ご紹介の論文も調べてみます。 弘法様 ありがとうございます。 やはり再現性の確認が大事とのこと・・・ とりあえず、コーディングリージョンが取れてきている6クローンについても 入れなおしてみます(計8クローン)。 今後ともよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1373-13 - 2012/01/02 (月) 21:22:22 - 弘法 今回のようなケースでは、問題がどこにあるかわからないので、まずはシークエンスを決めた35クローン（それが無理ならそのうちランダムに10クローン程度）からpreyプラスミドを回収し、再現性を確認すべきです。ランダムなスクリーニングにおいては、「部分は全体を反映」しているでしょうから。方針を決めるのはその結果を見てからでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1373-12 - 2012/01/02 (月) 21:14:36 - SS 以前クロンテックのmatchmaker3を使ってスクリーニングをしました。 私の時は1回のスクリーニングで陽性コロニーが120個くらい取れました。 候補を絞り込む基準は �@同タンパクの共通した領域が複数の陽性コロニーから検出されているもの �Abaitを全長、特定ドメインのみの両者でスクリーニングを行い、共通して陽性コロニーとして検出されたもの �B発現細胞がbaitと共通しているもの としていました。 酵母ではフレームシフトが起こりやすいのでフレームシフトは除外基準には入れませんでした。 またGolemisさんのY2Hに関する論文だと転写因子やフェリチンなどは偽陽性として検出されやすいとなっていたので、それらも除外して最終的には10種類くらいまで絞り込みました。 酵母へのCo-transformは省いて、哺乳細胞でのCo-IPに進んでしまいましたが、候補タンパクのうち一つがCo-IPで結合していました。

(無題) 削除/引用 No.1373-11 - 2011/12/31 (土) 01:07:59 - 酵母 ~さん ありがとうございます。 フレームシフトしたもので有望そうなものがあれば確認してみます。 コロニーPCRからのダイレクトシークエンシングが気にかかるとのことですが、シークエンスの結果から、プラスミド配列はきちんと入っていることが確認できています。 この件についてクロンテックに問い合わせましたが、ゲノムの混入は完全には除けないこと、intronic/genomic sequencesは他のalternative splicingによってexonとなるかもしれないという可能性があるとの回答を得ました。 シークエンスする前に偽陽性を落とすのが先とも考えられますが、240個のコロニーを一つ一つco-transformして確認するべきでしょうか･･･

(無題) 削除/引用 No.1373-9 - 2011/12/30 (金) 17:56:04 - ~ 私なら、フレームシフトが起こっていそうでも、入れ直した結果を見るまでは捨てません。 また、気になるのは、コロニーPCRからのダイレクトシークエンシングなのですよね。 非特異でゲノムDNAを増やしていませんかね。 プライマー直後にプラスミドの配列は見えているのでしょうか。

genome コンタミ 削除/引用 No.1373-8 - 2011/12/29 (木) 08:37:19 - 酵母 追加で質問をさせてください。 解析した35例のうち、6例はゲノム配列がヒットしてきていました。 購入したライブラリはcDNAライブラリのはずで、ゲノム配列がヒットしてくる可能性はあるのでしょうか? 確率的にも20%近くがゲノムというのはライブラリのクオリティが心配です。 クロンテックのデータシートにはマウス脳由来mRNAを用いて作ったと書いてあるのですが･･･

(無題) 削除/引用 No.1373-7 - 2011/12/29 (木) 06:20:48 - 酵母 基　様 ありがとうございます。 今のところ、重複して取れている意味のありそうなものはないですね・・・ 無意味なアミノ酸配列が重複しているかは確認していないので、そこを見てみます。 より多くの情報を得るには、シークエンスを進めたほうがよいかもしれませんね。 うちのBossはシークエンスをたくさんすると怒る人なので難しいところです･･･ 関連のあるタンパクか否かは、標的タンパクが機能不明なものなので、関連疾患から推測するしかないですが、見てみようと思います。 何かご意見などありましたら今後ともよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1373-6 - 2011/12/29 (木) 06:07:38 - 基 ええと、責任は持てませんが、フレームシフトしているなら、私なら捨てます。 ただし、フレームシフトした状態の一見無意味みえるアミノ酸配列がいくつもとれていれば、Baitはそのアミノ酸配列に結合している可能性を忘れてはなりません。この場合はアミノ酸のデータベースで検討します。 フレームシフトしていないものも、複数とれているか？　関連のある蛋白かどうか？がその系を進めるかどうかという上での基本になります。サイエンスとしては一見関連のない蛋白の方が面白いこともありますが。

(無題) 削除/引用 No.1373-5 - 2011/12/29 (木) 05:52:08 - 酵母 皆様 アドバイスありがとうございます。 シークエンスについては読めているものの波形はきれいでした。 とりあえず、フレームの合っていたクローン二つについてbaitとco-transformして相互作用の確認をしてみるつもりです。 使用しているライブラリーはクロンテックのNormalized mate & plate libraryというものです。 配列についてよく確認したところ、配列を読んだものが35個、そのうちコーディングリージョンのものが12個、そのうちインフレームのものが4個という内訳でした。 酵母では翻訳フレームシフトが起こりうるとマニュアルにはありましたが、それを考慮してフレームシフトしたものも再度入れなおしてみるべきでしょうか? 質問ばかりで申し訳ありませんが、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1373-4 - 2011/12/28 (水) 08:22:41 - 基 取れてきたものに意味がありそうなら、ダメとは判断しにくいですね。つまりその配列によって自分で考えなければいけない。また、指摘のあるようにクローン化して入れなおすのも基本的なこと。

(無題) 削除/引用 No.1373-3 - 2011/12/27 (火) 11:09:41 - ~ シークエンスを読んだPreyを再度入れなおしてみてはいかがでしょうか。 数個試して、どれもライブラリを入れたときと同じくらいの頻度で出てくるのか、一面に生えてくるのかで、偽陽性かどうかの結論が出せるでしょう。 また、気になるのは、40個の配列が別々で、それぞれにフレームシフトが起きているという状況です。 ライブラリが市販か自作かは分かりませんが、異常な頻度だと思います。 コロニーPCR→シークエンシングがうまくいっておらず、波形が汚くてそう見えているだけだったりしませんか？

(無題) 削除/引用 No.1373-2 - 2011/12/27 (火) 09:07:57 - Harmonia そのシステムは良く知りませんが、１個の酵母の中に、ポジティブなシグナルを出すプラスミドとそれ以外が入っていて、シーケンスしたのはそれ以外の方だった、ということはないですか？

yeast two hybridについて 削除/引用 No.1373-1 - 2011/12/24 (土) 07:37:31 - 酵母 クロンテック社のmatchmaker goldを用いてとあるタンパクの相互作用について検討しています。 このタンパクのC末250aaをbaitとしてスクリーニングしたところ、合計240個の陽性？コロニーがとれました。(SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-a-gal/AbA) この中で青色の濃い、大きなコロニーを40個ほどコロニーPCRし、シークエンスしてみたのですが、ほとんどの配列が途中にstopコドンが入ってしまっており(フレームシフトのため)、実質相互作用したと思われるペプチド長は100aa以下ばかりでした。インサートされたpreyの電気泳動像では、1000bp以上のものがほとんどで300aaくらいのものがいくらかあってもいいのかと思っていたのですが、こんなものでしょうか？ それとも、行ったスクリーニングに何か不備があり、偽陽性しか釣れていないということでしょうか？ baitの自律活性化試験は行いましたが、陰性でした。 考えられる解決策などありましたら教えていただけませんでしょうか。

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