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(無題) 削除/引用 No.4689-40 - 2015/12/25 (金) 15:33:19 - おお Ponceau Sも酢酸を入れるプロトコールがでまわってます。私のしめしたCBBの染色ではリンク先では、、、ちょっといまみれませんけど。 アミドブラックはイソプロパノールが入っていてNC膜の支持体に与える影響が大きくって丸まったりするので向かないと聞いたことがあります。支持体が入ってないやつだといいのかなぁって思ったことがありますが。たしかにアミドブラックはシグマのレシピでは１０％酢酸でかなり高いですね。。。Ponceau Sに入れているのは今思い出せないですけどこんなに高くないはずです。コロイダルであればリン酸と硫安か硫酸アルミニウムでてきているのではないかと。それで改善するのかな、、、バックは出そうな気もしてきました。 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Datasheet/6/a8181dat.pdf あ、でもシグマではアミドブラックでNC膜の染色を勧めてますね。バックグランドはCBBが高いとかいてます。一生懸命バックを落とすと見ているシグナルも落ちてしまっているかもしれません。支持体に関しては書いてないようですけど、、、、 個人的にはでPonceau S染色する方法を私は勧めます。

(無題) 削除/引用 No.4689-39 - 2015/12/25 (金) 15:32:41 - cbb なるほど、新しい情報を知らない人と古い情報を知らない人で理解が違ったわけですね。 最近はメタノールも酢酸も含まない組成のCBB染色液が多くなっているので、NC膜でも染めることができるようになったということですね。

(無題) 削除/引用 No.4689-38 - 2015/12/25 (金) 15:16:25 - AP >しかも、教科書なんかにはCBBやAmido blackはNC膜を侵すので不向き、というこは書いてあったりする。 一応、わたしの言う出典を書いておくと、 Antibodies: A Laboratory Manual 最近、待望の第二版がでたけれど、私が持っているのは第一版の復刻版

(無題) 削除/引用 No.4689-37 - 2015/12/25 (金) 15:06:52 - AP 話の流れがどうなっているのかわからん。 タンパク質ブロット膜の染色に関しては、まず免疫検出と両立できるか否かという選択があって、 両立できるのが、Ponceau S, India Ink (墨汁） できないのが、CBB, Amido black しかも、教科書なんかにはCBBやAmido blackはNC膜を侵すので不向き、というこは書いてあったりする。 それを勉強して記憶している人が、そこを指摘しているだけでしょう。 >これといってnitrocellulose膜でCBBを使用してはいけない、という記述は見つかりませんね。 >根拠無しの情報は困りものですね。 でも、酢酸がNCを溶解するという情報はあるはずだろう。化学の下地があれば予想もつくことじゃないか。7.5%酢酸が染色にかける時間のなかで、どの程度NC膜がやられるか、それが自分の実験にどの程度影響するかはそれぞれだが、多かれ少なかれ膜が侵されるのは確か。 CBBもメタ抜き、酢抜きとかいろいろ派生型がでているので、組成にも因るだろう。

(無題) 削除/引用 No.4689-36 - 2015/12/25 (金) 14:57:28 - おお もしかしたらNC膜でもブロッキングをPVPみたいな蛋白性でないのものにすれば染めれるかもしれませんけど、まあこれも想像しているだけですが、、、 CBBはほぼパーマネントな染色になってしまうという記述を見たような気がしますし、WBの感度に影響しやすいという話も聞いたことがありますので、個人的にはやりませんけどね。

(無題) 削除/引用 No.4689-35 - 2015/12/25 (金) 13:04:48 - cbb TaKaRaのはCBB Safe Stainという試薬のプロトコールをみました。 colloidalかどうかはちょっとわかりません。 ブロッキングしたメンブレンは染められないというのは、バックが高くなるだろうと予想できるので納得できます。 ちなみに、PVDFだとブロッキングした後でも染めることはできています。 これといってnitrocellulose膜でCBBを使用してはいけない、という記述は見つかりませんね。 根拠無しの情報は困りものですね。

(無題) 削除/引用 No.4689-34 - 2015/12/24 (木) 09:50:22 - おお http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/5/pdb.prot4544.full 調べてみました。こちらの方法では使えるようです。タカラのやつはコロイダルでしょうか。上記のやつはそうでないようです。

(無題) 削除/引用 No.4689-33 - 2015/12/24 (木) 08:11:40 - おお 私も疑問を投げかけているがわで、実際使えるかどうかについてよくわかりません。 BlueNativePAGEでCBBと一緒にサンプルをながして、CBBがサンプルについた状態でながれる電気えいどうがあります。負電極側にCBBがはいっていてゲル全体にCBBがある状態になりますけど、そのゲルをNC膜に写すとよくないとNature Protocolsにかかれていました。それからの連想であまりよくないのかなぁとおもって実際どうなのか知っている人がいないか話を振ってみた次第です。 CBBも染色方法が最近バリエーションが出てきてますのでその辺も気になるところです。

(無題) 削除/引用 No.4689-32 - 2015/12/24 (木) 07:51:09 - cbb 話題がずれますけど、nitrocellulose膜の染色にCBBは使えないという意見があるけど、どういう意味で使えないのでしょう？ 染まらないとか、バックが高いとか？実際やってみたことある方の意見が聞きたいです。 PVDFしか使ったことないのでちょっと調べたら、TaKaRaの製品は使えると書いてるし、実際染めてる図を載せてる例もあって（doi:10.1016/j.ab.2004.11.010）、問題なさそうに見えるのだけど。 感度もPVDFとも遜色ないようですが。

(無題) 削除/引用 No.4689-31 - 2015/12/24 (木) 01:32:25 - しろ サンプルのバンド「だけ」見ることができないのでしょうか。他のプロテイン、インターナルコントロール等で反応させてもバンドでませんか？

(無題) 削除/引用 No.4689-30 - 2015/12/23 (水) 00:17:48 - くぁwせdrftgyふじこlp だね。ニトロセルロースにはCBBは駄目だね。ニトロセルロースはポンソーかアミドブラックで染めるんだったと思う。検出感度はCBBには劣るけどきれいに染まる。普及した方法なので、ネットで探せばやり方や試薬の作り方は見つかると思う。

(無題) 削除/引用 No.4689-29 - 2015/12/22 (火) 03:35:01 - おお ニトロセルロース膜でCBBって相性があまりよくないような気がしますが、どうなんでしょうかねぇ。BNPAGEのWBではCBBがくっついて取れなくなるので、CBBイメージがきれいに見えないか、キャパを超えて蛋白がつかないかの理由で推奨されてませんよね。

(無題) 削除/引用 No.4689-28 - 2015/12/22 (火) 03:30:23 - おお 人のことはいえませんが情報が小出しになっているのでみなさんかなり幅広い答えを書いていますが、ゲルはトランスファーしない状態ではそまるらしいですし、トランスファーすればゲルは染まらないということなので、膜に写ってない可能性は高いかと思えます。確かにCBBの膜上での感度がゲルと比べるとどうなのかとかはありますが、、、 メタノールは7.5%入っているようですね。通常のtransfer bufferには20%入れるのがポピュラーな方法です。高分子ということも手伝って下げているのかとも思えますが、メタノールは膜の吸着性をあげる効果がありますので、吸着していないなら上げる方がいいでしょう(ただしゲルへの吸着効率も上げます)。あるいはSDSはゲルからの抽出効率をあげますが、膜の吸着性を弱めますので下げるか入れない方が妥当かと思います。いずれにしろ両方のバランスで膜転写効率が変わってきますので、やみくもにいじるよりよく考えて条件を絞っていった方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4689-27 - 2015/12/21 (月) 23:49:38 - obes もう一度全プロトコルを確認しなおしてみます。 皆様大変ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4689-26 - 2015/12/21 (月) 21:42:43 - くぁswでふいjこlp＠； 膜はNCでもいいけど吸着容量というか膜へのトラップのこと考えるとPVDFにしてみたらどうか。あとWET式で、Tris/Glycine/20%メタノールにSDS(最終濃度が0.01~0.05%くらいの範囲で適当に。ただし0.1%は越えないこと）いれる。上から下まで余裕で転写できてて、ゲルにもほとんど残らない。 電気的性質上（高塩基性蛋白質とか）極めて移りにくい蛋白質はたしかにあるけど、SDS添加である程度改善する。 加熱処理すると凝集してゲルにうまく入らなくなるのも稀にあるから、スタッキングゲルも一緒にウェスタンしてみることも大事かもしれない。 CBBで膜染めて確認ということについては、見たい蛋白質がCBBで染まるほど大量にあるならばそれでもいいのかもしれなけどふつうそういうことはかなりレアケースというかながくウェスタンしてる人でもほとんど経験ないとおもうのでたぶんCBBで染めてこの「バンドがそれ」、とかは分からないので、染まらない＝転写されてないとかそううことは分からないと思うので、やっぱウェスタンして確認しないと解決しないとおもう。 ミニゲルで5μgも流せばCBBでそれなりの数のバンドがちゃんと染まるので、それなりの量アプライしてCBBで染めて、それでも高〜低分子量に渡ってほとんどバンドが検出できないなら、これは転写自体の技術的問題とおもう。転写bufferの組成、通電時間や電流値が不十分、ゲルと膜の密着不良（ろ紙が少ないとかで緩くて隙間できてるとか）、機器が壊れてるとかかもしれない。 シグナル全然出ない、と悩んでいる人によくあるんだが、そもそもその蛋白質がちゃんと抽出出来てないのかもしれない。つまり泳動するサンプル中に目指すものがほとんどふくまれていないということで、だとしたらウェスタンの条件をいくら検討したところで埒が開かないので、これは抽出条件を検討するか、出来るだけ無差別に多種類の蛋白質を可溶化しうるような可溶化能の強いlysis buffer（SDS sample bufferとか)を使うとかしてみるといい。

(無題) 削除/引用 No.4689-25 - 2015/12/21 (月) 20:56:51 - おお よくわからんのだけどセミドライとか、電極の間がかなり狭かったらありうる条件と思うんですが、、、どの装置を使ってるんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.4689-24 - 2015/12/21 (月) 19:57:59 - モモ ここもつっこみどころでは？ >転写時間は30Vで１時間行いました。

(無題) 削除/引用 No.4689-23 - 2015/12/21 (月) 16:17:56 - おお 小出しですいませんが、SDSはいれるにしても0.01%ぐらいで十分です。まずはそれでやって、目的の蛋白の挙動をおってまだ完全にTransferされないとか特別な理由があるなら0.02%とか0.04%とかあげて至適化をはかるというのはありですが、まあたいてい必要なら0.01%でいいとおもいます。わたしは入れてませんしいれなくて今まで問題があったという感しょくはありません。

(無題) 削除/引用 No.4689-22 - 2015/12/21 (月) 16:14:22 - obes gel様 ありがとうございます。 バッファーの検討をもう一度してみます。

(無題) 削除/引用 No.4689-21 - 2015/12/21 (月) 16:01:14 - gel なるほど、他にやっている人はいないのですね。 転写装置もDRCのものなら、転写効率がかなりよいので転写1時間はやりすぎです。 他の会社のものを使用している場合でも、transfer bufferの組成を変えて改善できると思います。 Towbin bufferで調べてみましょう。

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