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(無題) 削除/引用 No.4689-20 - 2015/12/21 (月) 15:54:30 - obes gel様 今の研究室では他にウエスタンしてる人がいないのでわからないです。

(無題) 削除/引用 No.4689-19 - 2015/12/21 (月) 15:52:29 - gel SDSかなー それより、他の人はこの条件で上手く行っているのか気になる

(無題) 削除/引用 No.4689-18 - 2015/12/21 (月) 15:50:11 - obes 目的タンパク質は260kDa 使用ゲル濃度は5% バッファーはtris/glycine/SDS（DRC社）に7.5%のメタノールを加えています。 メンブレンはGE Healthcareのニトロセルロース膜0.45を使用しました。 転写時間は30Vで１時間行いました。

(無題) 削除/引用 No.4689-17 - 2015/12/21 (月) 15:44:53 - おお トランスファーの条件と時間も気になるところですけど、、、

(無題) 削除/引用 No.4689-16 - 2015/12/21 (月) 15:43:21 - AP PDVFではメタノール抜きという選択肢もあるが、ニトロセルロースでは無理スジ

(無題) 削除/引用 No.4689-15 - 2015/12/21 (月) 15:41:11 - おお SDS抜いてください。ニトロセルロールはあまりSDSと相性がよくないし。あるいはSDS入れてもいいけどメタノールを１０％ぐらい加えてください。

(無題) 削除/引用 No.4689-14 - 2015/12/21 (月) 15:41:04 - AP 転写しにくいタンパク質を転写するのにSDSを加えることはあるが、いくら高分子量と言ったってニトロセルロースだとスッポ抜ける可能性が高いですよ。しかもメタノール入っていないんじゃないの？

(無題) 削除/引用 No.4689-13 - 2015/12/21 (月) 15:38:45 - AP >バッファーはTris/glycine/SDSのバッファーを使用しています。 転写後のゲルには残っていないということは、膜を通り抜けているか、極端な場合は逆に流れているかも。となると、メンブレンの種類やトランスファバッファnの濃度組成やpHなどの情報もほしいところ。 情報が小出しになっているので、みんなの疑問点をまとめて答えて、情報を一括したほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4689-12 - 2015/12/21 (月) 15:35:57 - obes CBBの染色は純粋で洗い流せるものと脱色液を使うものどちらも使用しました。 純粋で洗い流しできるものは、一時間染色後、５分間洗浄しました。 脱色液を使うほうは、一時間染色後、４時間脱色しました

(無題) 削除/引用 No.4689-11 - 2015/12/21 (月) 15:32:49 - obes メンブレンはニトロセルロース膜を使っています。

(無題) 削除/引用 No.4689-10 - 2015/12/21 (月) 15:31:14 - gel 転写後のゲルにもバンドが見えないということは、転写しすぎ？ CBBの染色の方法は？

(無題) 削除/引用 No.4689-9 - 2015/12/21 (月) 15:29:36 - obes AP様 ウエスタンブロットはタンク式を使っています。 バッファーはTris/glycine/SDSのバッファーを使用しています。 標的タンパク質の分子量は260kDaで、ゲルは5%を使っています。

(無題) 削除/引用 No.4689-8 - 2015/12/21 (月) 15:27:22 - おお 転写のバッファーと膜の種類を教えていただけますか？

(無題) 削除/引用 No.4689-7 - 2015/12/21 (月) 15:26:44 - み APさんが言うように 高分子とか書いてあるけど何kDaの蛋白を何%ゲルで泳動しているのかな？ １次抗体の反応性は確かなのかな？ワークしない抗体なんていくらでもあるからな。 写真を撮ってもバンドがでないって、検出系は何かな。一連の検出系に問題はないのか？ アクチンなど検出しやすい蛋白に関するwesternは問題ないのかなど、どこからどこまで問題ないかを区別しないとね。 そもそもゲルに流した標的の蛋白は上手く調製されているのか？

(無題) 削除/引用 No.4689-6 - 2015/12/21 (月) 15:26:09 - おお >[Re:3] APさんは書きました : > 転写後のメンブレンを染めてみて見えないというのだから転写されていないのでしょう。転写後のゲルは染めてみましたか。 細胞のLysatesとかで標的のバンドがCBBで染まらないって言っているような危惧が、、、どれくらい大きいかわかりませんけど、高いところはそんなにタンパク量もないし、、、

(無題) 削除/引用 No.4689-5 - 2015/12/21 (月) 15:23:53 - obes おお様 転写した後のゲルもCBBで染色したところ、何もありませんでした。 また、ゲルを二枚用意して、一枚を電気泳動してCBBしたところバンドはしっかり出ていました。もう一枚は転写してゲルとメンブレンをCBBで染色したところ、ゲルにはバンドがなく、メンブレンにはレインボーマーカーのバンドのみしかでませんでした。 ポンソーSでも染色しましたが、全くバンドが出ませんでした。

(無題) 削除/引用 No.4689-4 - 2015/12/21 (月) 15:15:55 - おお >ゲルで転写前と転写後でCBBで染めてみた 染色したゲルをトランスファーするんじゃないよ。たとえば同じサンプルを２レーンながして一方はそのままCBBもう一方はトランスファーに使ってからCBB

(無題) 削除/引用 No.4689-3 - 2015/12/21 (月) 15:14:37 - AP 転写後のメンブレンを染めてみて見えないというのだから転写されていないのでしょう。転写後のゲルは染めてみましたか。 WBの転写法には大きく、ウェットブロット（タンクブロット）とセミドライブロットの二種類があります。どちらでしょうか。 また、それぞれの方法でも転写バッファーに沢山のバリエーションがあります。どんなのを使っているんでしょうか。 標的タンパク質のサイズとゲル濃度はいかほどでしょうか。 標的タンパク質の等電点が極端に高かったり低かったりということはありますか。

(無題) 削除/引用 No.4689-2 - 2015/12/21 (月) 15:13:38 - おお えっとCBBで染まって確認できるほどの量がバントとしてあるの、、、転写後のゲルはCBBで染めて検出された？ゲルで転写前と転写後でCBBで染めてみた（なるだけ同じ条件で ）。 あと膜のほうはわたしはPonceau S 派なんでCBBはあまり使わんのだけど、、、なので感度とかコツとかよくわからんけど。

ウエスタンブロット法の転写について 削除/引用 No.4689-1 - 2015/12/21 (月) 14:55:21 - obes 今、ウエスタンブロット法を用いてある高分子タンパク質の定量実験をしています。 抗体反応後、写真をとってもバンドが全く出なかったので、指導教官に聞いたところ、転写がうまくできていないと指摘されました。 その後、転写を行ってから、抗体反応をさせずCBB染色で染めて転写ができているかを繰り返し行っている状況にあります。 しかし、レインボーマーカーはメンブレンに転写されていることは確認できるのですが、サンプルのバンドは染色しても全く見ることができません。 もし、原因がわかる方がいましたらよろしくお願いいたします。 ウエスタンブロット法は、初めてで勉強不足のことが多いですがよろしくお願いいたします。

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