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(無題) 削除/引用 No.6203-12 - 2017/08/22 (火) 23:31:23 - mon >漏洩発現とはL-アラビノースを加えずともλRedが発現してしまうという事なのでしょうか？ そうです。araBAD promoterはoff制御が厳密な方ですが、０ではないので。 でも、N567株はendA-でないので、APさん、小言幸兵衛さんの指摘通り通常のアルカリSDS法だけではヌクレアーゼが残存している可能性高いですね。 フェノール（ or フェノール・クロロホルム）抽出するかカラム（ or シリカ）精製した法が安全ですね。 あるいは多めの制限酵素で短時間(10分程度）処理で泳動するか。。 制限酵素処理前のTE（通常はEDTAのおかげでヌクレアーゼが働かない）に溶解した液を直接泳動してもバンドは見えませんか？ 培養液を直接フェノール・クロロホルム抽出、EtOH沈殿、TE-RNaseに溶解、でもplasmidがあるかないかは判別出来ます。

(無題) 削除/引用 No.6203-11 - 2017/08/22 (火) 20:46:53 - 小言幸兵衛 miniprepはどうやってますか。APさんがおっしゃってるように、残存しているエンドヌクレアーゼ活性で制限酵素消化中にプラスミドが分解してるんじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.6203-10 - 2017/08/22 (火) 18:57:23 - みく 小言幸兵衛さん、monさん、ご指摘ありがとうございます。 今回、形質転換がされていないと判断した根拠としましては、miniprepしたサンプルを制限酵素消化して泳動パターンをチェックしましたところ、バンドが存在していないという結果が得られた事から判断いたしました。(DH5αですとpCas9-CR4は6770bp, pKDsgRNA-ackは6959bp付近にバンドが確認されました。) コロニーが得られている（CamR、SpecRになっている）のであれば確かに形質は転換されていると言えますが、プラスミドがきちんと2つ入っていない細胞ですとdsDNAをエレポレした際に相同組換えが生じずゲノムに変異を加えられないので困っております。 また、λRed発現の為にL-アラビノースを加えて培養したものをエレクトロポレーションコンペテントにするのは次の段階なのですが、勉強不足で申し訳ありませんが漏洩発現とはL-アラビノースを加えずともλRedが発現してしまうという事なのでしょうか？とんちんかんな事を聞いてしまっていたら申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.6203-9 - 2017/08/22 (火) 18:14:16 - AP N567絡みのトラブルの過去トピがあるのでご参考まで http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1529 その中で、N567の遺伝子型が載っている文献がおおさんから http://www.biomedsearch.com/attachments/00/02/52/73/2527353/nar00131-0146.pdf

(無題) 削除/引用 No.6203-8 - 2017/08/22 (火) 17:57:05 - mon 小言幸兵衛さん、ご指摘の通り少しズレていましたね。 N567株を探すとRho-(anti-terminator)らしいですが、ご使用のplasmidとは関係なさそう。。 pKDsgRNA-ackは、araBAD promoter でλRedシステムを誘導するplasmidですね。 λRedシステムは強力な相同組み換え酵素なので、もしかすると漏洩発現が悪さしているのかもしれません。多少でもそれを弱めるためにglucoseを1%程度添加してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6203-7 - 2017/08/18 (金) 20:55:24 - 小言幸兵衛 えーと、皆さんが聞きたいこととはちょっとズレてませんか。 「形質転換が出来ていない」というのはどういう意味で言ってますか、ってことだと思うんですけど。CamR、SpecRになっているのであれば、ホスト株の薬剤耐性という「形質」は確かに「転換」されていますよね。 miniprepしたサンプルを制限酵素消化して泳動パターンをチェックしたということは書いてあります。その結果がどうだったとおっしゃってるんですか？バンドが確認できなかったのか、バンドはあるけど予想サイズと違っていたのか。つまり何をもって「形質転換が出来ていない」と判断したのですか？

(無題) 削除/引用 No.6203-6 - 2017/08/18 (金) 17:53:50 - みく 情報量の不足を指摘していただきありがとうございます。 まず、N567株についてですが、未だに全ゲノムの解析がなされていない状態の株です。しかし、K-12株を改変して作成したものという事はわかっております。 pAC, pBRというのはmonさんのご指摘の通りpACYC系plasmid, pBR322系の事です。また、pCas9, pKDsgRNAについてのプラスミドマップは、 pCas9-CR4 https://www.addgene.org/62655/ pKDsgRNA-ack https://www.addgene.org/62654/ こちらに購入元の情報が載っています。 N567にpCas9単独で形質転換は成功しています(形質転換→miniprep→制限酵素切断→ゲルチェックの流れで確認。)が、N567にpKDsgRNAを単独では形質転換したことはありませんでした。DH5αでは、pCas9, pKDsgRNAそれぞれ単独での形質転換が確認できています。また、この2つのプラスミドが形質転換されているのかを確認する際にも形質転換→miniprep→制限酵素切断→ゲルチェックの流れで確認しております。

(無題) 削除/引用 No.6203-5 - 2017/08/11 (金) 07:40:55 - AP >コントロールとして流したpCas9, pKDsgRNAの位置にバンドが見られず形質転換が出来ていないという事が確認されました。 違う位置にはバンドがあったということか？ プラスミドは制限酵素消化してから泳動したのだろうか？ それをせずに泳動したなら、高次構造で違う位置にバンドが見えるということはありえる。例えば、 ・宿主のエンドヌクレアーゼ活性が高く、プラスミドが全てopec circularになっている ・宿主のトポイソメラーぜの関係か何かで、プラスミドがコンカテマー化(カテナン化)している。

(無題) 削除/引用 No.6203-4 - 2017/08/10 (木) 22:38:22 - mon plasmidの和合性について、例えば https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/8910/8910_yomoyama-2.pdf

(無題) 削除/引用 No.6203-3 - 2017/08/10 (木) 22:36:37 - mon (4)pCas9, pKDsgRNAというplasmidの情報もお願いします。どのような構成でしょうか？例えばどのような遺伝子が載っているのか、mapがwebで参照できればそのaddress等

(無題) 削除/引用 No.6203-2 - 2017/08/10 (木) 22:33:20 - mon 大腸菌なので、細胞というと違和感が有ります。N567「株」ですね。 議論するには情報が足りないので、3点質問があります。 (1)N567株はマイナーな株なので遺伝子型が判れば記載してください（重要）。 通常はoriが和合性があり薬剤耐性が異なれば、同時に(混合して）２種のplasmidを導入・選抜は容易です。これを踏まえて、 (2)pCas9, pKDsgRNAとpAC, pBRの関係が不明です。 pACとかpBRというplasmidは報告されていませんので（あなただけ判る）スラングです。おそらくpACはpACYC系plasmidでp15Aレプリコン、pBRとはpBR322系plasmidでColE1型レプリコン(これもpBR322系とその変異型pUC系で性質が異なる）の事でしょうか。まあ、文面からはpCas9, pKDsgRNAの一方がp15Aレプリコン、pKDsgRNAがColE1型レプリコンなのかな〜とは想像出来ますが。。。 (3)＞因みに、N567細胞はpAC, pBRの2つのプラスミドの形質転換は問題なく行えます。 と記載していますが、pCas9, pKDsgRNA単独では形質転換できると言うことでしょうか？それとも別のplasmidでしょうか？

細胞種によるプラスミド形質転換の可否について 削除/引用 No.6203-1 - 2017/08/10 (木) 16:42:36 - みく こんにちは、よくわからないことが起きたので助言を頂けると幸いです。 私は大腸菌N567細胞にpCas9-CR4, pKDsgRNA-ackを形質転換し、エレクトロポレーションコンペテントにした後にdsDNAをエレポレし、相同組換えを生じさせゲノムに変異を加えようとしています。(no-SCAR法)その途中でつまずいてしまっているので解決の手がかりが欲しくトピックを作らせていただきました。 問題と言うのは、N567細胞にpCas9, pKDsgRNAの2種類のプラスミドが形質転換できないという所にあります。 手順としては、 N567にpCas9(Cam r)を37℃ 90sでheatshock、37℃で1h回復の後LB/Camに蒔き37℃ 16h培養 得られたコロニーからheatshock用の細胞を作製 （同時にminiprepを行いpCas9が形質転換ができていることを確認） 作製したN567/ pCas9にpKDsgRNA(Spec r)を37℃ 90sでheatshock、30℃で2h回復の後LB/Cam, Specに蒔き30℃ 20h培養 (pKDは温度感受性である為30℃での培養) 得られたコロニーをminiprepし、アガロースゲル泳動を行ったところ、コントロールとして流したpCas9, pKDsgRNAの位置にバンドが見られず形質転換が出来ていないという事が確認されました。 更に、細胞をDH5αに変えて上記の手順で実験を行った結果miniprepによりプラスミドは2つ確認されました。 因みに、N567細胞はpAC, pBRの2つのプラスミドの形質転換は問題なく行えます。 細胞種とプラスミドの組み合わせにより形質転換が行えないという事が起こり得るのでしょうか。稚拙な質問でありましたら申し訳ないです。

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