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(無題) 削除/引用 No.8431-3 - 2019/11/21 (木) 07:14:09 - moz アニール・リン酸化したオリゴDNAだけで多めにライゲーションして、電気泳動で3量体以上のラダーバンド〜スメアが観察できるか見てみれば？ オリゴDNA・ベクターのモル比も、10倍以下に抑えた方がよいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.8431-2 - 2019/11/21 (木) 04:59:02 - おお 3kb のPCR産物のクローニングがうまく行っているんだから、Ligationの活性がある条件だと思いますが、、、より短いDNA断片のほうがLigation、Transformation効率が高いと思いますので、一次的な原因は他にあると思います。 オリゴのアニーリングがちゃんとできているかとか、加えている量とか。 Ligaseは低い温度の方が良いとは言われてましたけど、最近は酵素量を増やしていたりして３７度でできるキットもあるような気がする。私は念の為ATPを追加して使ってます。むかし古いLigation Bufferを使ったときうまく行かなかったのでATPを追加してみたらうまく行ったという事がありましたので。

ライゲーションが上手くいきません 削除/引用 No.8431-1 - 2019/11/21 (木) 04:28:22 - 助けて欲しいです nebのt4 dna ligaseを用いてかれこれ2週間トライしてますが、クローニングできません。 3kb のPCR産物のクローニングはいくつかコロニーを拾いようやく取れましたが、最近やってる70bpほどのオリゴの挿入なんてちっともです… オリゴはすでにxba1切断してあるかのような末端をしてます。 リン酸化もしてます。ベクターはxba1カットして脱リンしてます。 今気づいたんですが、25°でライゲーション推奨で、通常のt4 dna ligaseは熱失活しやすいみたいで、もしかしたら私はこれまでずっと37度で2時間ほどしてきましたが、その間に失活してしまったかと危惧しています…やはりそういうことでしょうか…

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