Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る | トピック一覧 | 研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム(readのみ)

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

鎖置換型酵素であるphi29による増幅について トピック削除
No.10317-TOPIC - 2022/03/04 (金) 13:34:25 - yuuu
掲題の内容についてご相談があります。

鎖置換型酵素であるphi29は、全ゲノム増幅などに使われる酵素だと思いますが、サンガーシーケンスを行う為のプラスミド増幅にも使用されているかと思います(GE healthcare:templiphi kit)

templiphi kitを使用した場合、プラスミドを増幅させて良好なシーケンスデータを得ることができるのは検証済みなのですが、このキットを使用せず自前で個別に試薬を用意し、調整できればと考えております。

templiphi kitのマニュアルによると、必要となる試薬は「phi29/phi29 buffer/random prime(6mer)r/dNTP」のようで、templiphi kitのマニュアルを参考にして下記の手順にて調整しました。

@精製済みプラスミドにrandomprimerと滅菌水を混合し、95℃で3minヒートショック→4℃急冷
U上記溶液にdNTP、phi29buffer、phi29を混合し、30℃で18時間→65℃で10min(酵素失活処理)
V得られた溶液から1.5μl程度使用してシーケンス反応の鋳型とする

なお、上記で使用した試薬の量(終濃度)は下記のとおりです。
・精製済みプラスミド(1ng/μl)・・・1μl
・random primer・・・終濃度0.5μM
・dNTP・・・終濃度200μM each
・phi29 buffer・・・1μl
・phi29 ・・・0.1μl(1U)
・滅菌水・・・全量が10μlになるようにfill up

何度か上記の試薬と手順にて増幅を試みたのですが、サンガーシーケンスに持ち込んでも全く波形が得られず困っています。
もし上記の手順で怪しい点がありましたら、わかる方がいらっしゃればどなたかご指摘いただけるでしょうか。
長文失礼しました。
 
- このトピックにメッセージを投稿する -



6件 ( 1 〜 6 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.10317-6 - 2022/03/09 (水) 13:37:56 - yuuu
T-2さま 

ご返信ありがとうございます。

DTTについては、酵素はまだ購入したばかりで未使用でしたので、ヘタってはないと思っております。
電気泳動して確認してみます。

SYBR masterさま

論文の提示ありがとうございました。
random primerがthiol-bondすることでプライマーが消化されないのですね。

自分の中での疑問が解決しました。大変助かりました。
皆様ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.10317-5 - 2022/03/07 (月) 14:11:57 - SYBR master
このキットの元論文です。

Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification

https://genome.cshlp.org/content/11/6/1095.short

Phi29 DNA polymeraseはexo活性が非常に強いので、random primerの3末2塩基をthiol-bondにしてexo活性を阻害しています。このthiol-bondのため、新鮮なDTTは必須です。現在市販されているキットのprimerおよび酵素濃度は販売開始から、少し下げられたはずですが、基本組成は同じです。

このキットは基本templateが無くても増幅産物(template independent amplification)が起こります。現在の所、酵素由来のDNAが一番の原因と考えられています。この論文以降に、国内からも論文出ていますので、ご確認しご参考にしてください。

増幅が上手くいっているかどうかは、適切な制限酵素で切断して目的plasmidと同じサイズであるかどうか確認してください。

(無題) 削除/引用
No.10317-4 - 2022/03/07 (月) 09:02:22 - T-2
使用されている酵素のメーカー、バッファーの組成を示されたらどうでしょうか。
反応には還元剤が必須のようですが、DTTがヘタっている可能性はありませんか。
phi29による反応後、一部を電気泳動すれば反応が進行しているかはわかるはずですが。

(無題) 削除/引用
No.10317-3 - 2022/03/06 (日) 14:00:25 - yuuu
Hiro さん

ご返信ありがとうございます。
templiphiキットを使用した増幅は確認してますが、個別に用意した試薬での増幅は確認していません。サンガーシーケンスで波形が出てないので、反応自体うまく行ってないと思われます。

(無題) 削除/引用
No.10317-2 - 2022/03/06 (日) 08:59:20 - Hiro
反応自体が起こっているのは確認したのでしょうか?

鎖置換型酵素であるphi29による増幅について 削除/引用
No.10317-1 - 2022/03/04 (金) 13:34:25 - yuuu
掲題の内容についてご相談があります。

鎖置換型酵素であるphi29は、全ゲノム増幅などに使われる酵素だと思いますが、サンガーシーケンスを行う為のプラスミド増幅にも使用されているかと思います(GE healthcare:templiphi kit)

templiphi kitを使用した場合、プラスミドを増幅させて良好なシーケンスデータを得ることができるのは検証済みなのですが、このキットを使用せず自前で個別に試薬を用意し、調整できればと考えております。

templiphi kitのマニュアルによると、必要となる試薬は「phi29/phi29 buffer/random prime(6mer)r/dNTP」のようで、templiphi kitのマニュアルを参考にして下記の手順にて調整しました。

@精製済みプラスミドにrandomprimerと滅菌水を混合し、95℃で3minヒートショック→4℃急冷
U上記溶液にdNTP、phi29buffer、phi29を混合し、30℃で18時間→65℃で10min(酵素失活処理)
V得られた溶液から1.5μl程度使用してシーケンス反応の鋳型とする

なお、上記で使用した試薬の量(終濃度)は下記のとおりです。
・精製済みプラスミド(1ng/μl)・・・1μl
・random primer・・・終濃度0.5μM
・dNTP・・・終濃度200μM each
・phi29 buffer・・・1μl
・phi29 ・・・0.1μl(1U)
・滅菌水・・・全量が10μlになるようにfill up

何度か上記の試薬と手順にて増幅を試みたのですが、サンガーシーケンスに持ち込んでも全く波形が得られず困っています。
もし上記の手順で怪しい点がありましたら、わかる方がいらっしゃればどなたかご指摘いただけるでしょうか。
長文失礼しました。

6件 ( 1 〜 6 )  前 | 次  1/ 1. /1


パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール   アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存(次回の入力の手間を省けます)
上に上げない(トピックの一覧で一番上に移動させません)
解決(問題が解決した際にチェックしてください)
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 

〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。