Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る | トピック一覧 | 研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム(readのみ)

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

超高速でクローニングするには? トピック削除
No.10564-TOPIC - 2022/06/20 (月) 18:14:06 - E.coli
クローニングをする際にいつももっと早くクローニングできないのかなと思ってます。

よく行っている方法では

Day1
1. RNAからcDNA作製
2. プラスミドへクローニング(Gibson 15min)
3. 大腸菌をトランスフォーメーション

Day2
4. コロニーをピックアップ

Day3
5. ミニプレをしてシークエンス

となります。

3-5が律速段階となりますが、3-5のステップを短縮できる方法などはないですか?

例えば、超早くコロニーを形成する大腸菌があれば Day1でコロニーをピックアップできますが。
 
- このトピックにメッセージを投稿する -



25件 ( 1 〜 20 )  前 |  1/ 1. 2. /2


(無題) 削除/引用
No.10564-25 - 2022/06/25 (土) 00:05:17 - おお
>[Re:24] 利害無関係者さんは書きました :
> それはともかくとして、クローニングのステップを経ていないので、PCRのエラーも含めてヘテロな産物になりうるの可能性は常にあることはそのとおりだと思います。

あ、そうそうそういう感じのやつ。追記ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.10564-24 - 2022/06/24 (金) 07:33:49 - 利害無関係者
それはともかくとして、クローニングのステップを経ていないので、PCRのエラーも含めてヘテロな産物になりうるの可能性は常にあることはそのとおりだと思います。

シークエンスなどで大部分が望む産物であることが確認できれば、そういうものとして(マイナーなコンタミが存在しうるものとして)以後の実験をデザインするか、この段階で大腸菌に形質転換してクローニングすることになるのでしょうね。

(無題) 削除/引用
No.10564-23 - 2022/06/24 (金) 07:29:17 - 利害無関係者
下にあるの10断片の連結は「連結のためのキット」のデータなのでラダーになるのは当然では?

(無題) 削除/引用
No.10564-22 - 2022/06/23 (木) 22:40:27 - おお
>[Re:17] がさんは書きました :

> おおさんがコメントしていた、ヘテロな産物についてですが、
> これまで15種類程度のplasmidをassembleしてきましたが、ヘテロな産物は電気泳動レベルでは全く確認できないです。増幅した産物を大腸菌にトランスフォームしても、ほぼ100%目的産物です。
> 個人的な印象ですが、kitの性能としてはかなり優秀です(コストは高いですが)。

https://oriciro.wixsite.com/oriciro-jp
ここの下の方に10この連結を試みていますけど、10こ未満の産物ができていてヘテロですよね。
また、おそらくLigationしたようなものも増やせると思いますが、両端同じ酵素のコヘッシブであれば2種類(以上)の産物ができて、自動的にどちらかに偏るのも、ヘテロで増えるのも都合が悪いとかそういうことを考えていたのです。

(無題) 削除/引用
No.10564-21 - 2022/06/23 (木) 22:29:42 - おお
>[Re:20] TOKIOさんは書きました :
> https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cloning/topo/topo-ta-cloning/topo-ta-with-mach1-competent-cells.html
>
> mach1速すぎて使いにくい印象もありました笑
> が目的には合致しますか?

そうそう、朝TFして夜にミニプレップ用の培養を始めるのであれば増殖が速い菌株を使ったほうがいいと書こうと思っていて忘れてました。

(無題) 削除/引用
No.10564-20 - 2022/06/23 (木) 21:54:27 - TOKIO
https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cloning/topo/topo-ta-cloning/topo-ta-with-mach1-competent-cells.html

mach1速すぎて使いにくい印象もありました笑
が目的には合致しますか?

(無題) 削除/引用
No.10564-19 - 2022/06/23 (木) 16:39:16 - が
そうですか、雑すぎましたか。失礼しました。
ところで、Syberさんが質問された答えを得て知識を更新することができましたか?

(無題) 削除/引用
No.10564-18 - 2022/06/23 (木) 13:28:51 - SYBR master
>おおさん、利害無関係者様、
情報ありがとうございました、自分の中の知識を更新しておきます。

>[Re:17] がさんは書きました :
> >Syberさん
> kitで増幅できるから、大腸菌では増えないのでは?と考えるのは、どうでしょう。

勝手に私の質問を、あなたの脳内で変な変換しないでください。「OriCが二つあっても増えるのか?」って聞いたんですよ。そして僕の知っている知識では、「増えないと」考えたのです。また使用例で「Kitで再増幅している」所から、増えないから使い勝手が悪いと判断したんです。

なので
>間違えてます。できます
このエビデンスが付属していない情報では、更新できないのですよ、雑すぎて。

(無題) 削除/引用
No.10564-17 - 2022/06/23 (木) 09:15:04 - が
>Syberさん
oriciro何度も使用経験があってのコメントです。
大腸菌で増えます。
kitの目的は大腸菌クローニングから開放することを謳っていますので、kitで増幅させています。
kitで増幅できるから、大腸菌では増えないのでは?と考えるのは、どうでしょう。

おおさんがコメントしていた、ヘテロな産物についてですが、
これまで15種類程度のplasmidをassembleしてきましたが、ヘテロな産物は電気泳動レベルでは全く確認できないです。増幅した産物を大腸菌にトランスフォームしても、ほぼ100%目的産物です。
個人的な印象ですが、kitの性能としてはかなり優秀です(コストは高いですが)。

個人的には、かなりの頻度でplasmid constructionしていますが、殆どの場合が従来法の大腸菌を利用したクローニング方法でおこなっています。
トピ主のリクエストは、クローニングのスピードアップですが、その目的でoriciroは使っていません。コストが問題です。oriciroを使うのは、作製の困難な場合、断片が多い場合、サイズが大きい場合など、なにか特殊な理由がないと使っていません。

(無題) 削除/引用
No.10564-16 - 2022/06/23 (木) 08:10:55 - 利害無関係者
コピペをしくじりました。

However, when you combine with a high-copy pUC origin, then oriC will inhibit E. coli growth.

です。

(無題) 削除/引用
No.10564-15 - 2022/06/23 (木) 08:09:15 - 利害無関係者
パンフのFAQにもこうありました。

Q6 : Could a circular plasmid contains both oriC and another E. coli replication origin?

A6 : Basically, oriC does not interfere with the function of the other plasmid origin like ColE1, p15A or R6K even if it were combined. However, when you combine with a high-copy pUC origin, then oriC will inhibit E. coli gi growth. Also, another plasmid origin does not interfere with the in vitro amplification.

(無題) 削除/引用
No.10564-14 - 2022/06/23 (木) 07:36:38 - 利害無関係者
大腸菌中でもoriC依存的に複製されるようですが、ultra low copyでしょうね。

https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjg/66/1/66_1_85/_article/-char/ja/

(無題) 削除/引用
No.10564-13 - 2022/06/23 (木) 04:11:43 - おお
>[Re:12] SYBR masterさんは書きました :
> >[Re:11] がさんは書きました :
> >
> > >これって、大腸菌のOriCを組み込んでないと増幅出来ないので、作成できたplasmidは二度と大腸菌に形質>>転換できないと思うんだけど、何か私間違えてる?OriCを持つ2種類のDNAて大腸菌で存在できるの?
> >
> > 間違えてます。できます
>
> なら、なんで再度増やすとき、同じキット使っているの?
> できるなら、その根拠となる論文も、教えてください。

https://oriciro.wixsite.com/oriciro-jp

ここの真ん中からちょっと下のあたりに
「増幅産物は大腸菌への形質転換が可能」
とは書いてますが、わたしも文献など詳細が知りたいですね。pUC Oriなどの入ったプラスミドに組み込んで最終的にできたものは大腸菌内でpUC Oriで維持できるとか言う話なんでしょうか。。。

(無題) 削除/引用
No.10564-12 - 2022/06/22 (水) 23:59:59 - SYBR master
>[Re:11] がさんは書きました :
>
> >これって、大腸菌のOriCを組み込んでないと増幅出来ないので、作成できたplasmidは二度と大腸菌に形質>>転換できないと思うんだけど、何か私間違えてる?OriCを持つ2種類のDNAて大腸菌で存在できるの?
>
> 間違えてます。できます

なら、なんで再度増やすとき、同じキット使っているの?
できるなら、その根拠となる論文も、教えてください。

(無題) 削除/引用
No.10564-11 - 2022/06/22 (水) 20:10:17 - が

>これって、大腸菌のOriCを組み込んでないと増幅出来ないので、作成できたplasmidは二度と大腸菌に形質>>転換できないと思うんだけど、何か私間違えてる?OriCを持つ2種類のDNAて大腸菌で存在できるの?

間違えてます。できます

(無題) 削除/引用
No.10564-10 - 2022/06/22 (水) 18:21:51 - SYBR master
>[Re:4] 利害無関係者さんは書きました :
> こんなのは?
> https://oriciro.wixsite.com/oriciro-jp

これって、大腸菌のOriCを組み込んでないと増幅出来ないので、作成できたplasmidは二度と大腸菌に形質転換できないと思うんだけど、何か私間違えてる?OriCを持つ2種類のDNAて大腸菌で存在できるの?

(無題) 削除/引用
No.10564-9 - 2022/06/21 (火) 21:57:13 - おお
>[Re:4] 利害無関係者さんは書きました :
> こんなのは?
> https://oriciro.wixsite.com/oriciro-jp

面白いけど、できたものがヘテロな集団であったりするかもしれないという所が気になる点だ。

ダイレクトシーケンス 削除/引用
No.10564-8 - 2022/06/21 (火) 16:09:08 - akiboooooo
プラスミドを取らないで、コロニーダイレクトPCRして、
それをダイレクトシーケンスすれば1日早く結果がでます。

(無題) 削除/引用
No.10564-7 - 2022/06/21 (火) 15:41:13 - seventh
そもそも何を目的としてます?

(無題) 削除/引用
No.10564-6 - 2022/06/21 (火) 15:39:47 - が
私もoriciroに一票。コスト度外視ですが、時間を買うと思うと良いのでは

25件 ( 1 〜 20 )  前 |  1/ 1. 2. /2


パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール   アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存(次回の入力の手間を省けます)
上に上げない(トピックの一覧で一番上に移動させません)
解決(問題が解決した際にチェックしてください)
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 

〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。