全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.11863-7 - 2023/10/23 (月) 12:09:10 - ぱに ああ様 やはりEtOHに溶かしたほうがよいのですね。やってみます。ありがとうございます。 皆様から頂いた情報をもとに、脂肪酸Naを50％EtOHに溶解、BSA/PBSと混合後にソニケーションをして再チャレンジします。私の技術不足で上手く行かなかったら既製品を使用しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.11863-6 - 2023/10/20 (金) 15:39:58 - ああ ラボメンバーの方がHepG2へのパルミチン酸（PA）負荷で行っていた方法ですが、 １．EtOHにパルミチン酸 を加え70℃で溶解(500mM) ２．fatty acid(-)BSAをFBS(-)DMEMに溶解しフィルターろ過（多分10%） ３．パルミチン酸 10ul + BSA 990ulの溶液を55℃ 15min×2回でconjugate（5mM　stock） となっていました。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.11863-5 - 2023/10/20 (金) 10:15:45 - ぱに 皆様ありがとうございます。 decrfgthy様 確かに、文献を探していく中で既製品を使用しているものも見かけました。 実験を始める際に教授と「自分で作ってみてどうしても無理だったら買おう」という話もしましたので、既製品の使用も視野に入れようと思います。ありがとうございます。 あの様 PBSではなくEtOHのほうが溶けやすいということでしょうか。先輩はDMSOに溶かしていて、それ以外の溶媒は試したことがないので、やってみようと思います。ありがとうございます。 PPP様 パルミチン酸ナトリウムでもやはり溶けにくいものなのでしょうか。この方法は先生の知り合いの研究者に教えていただいた方法なのですが、脂肪酸の種類によっては厳しい場合もあるのですね。DMSOはあるので、先生と相談してみます。 Lipid Dropletは染色なしでも確認できるものなのでしょうか？おそらく研究室に染色試薬がなく。。。 ポジコンとして最初に上げた3つの遺伝子のどれかを結果に載せたいと考えているのですが、顕微鏡写真で脂肪滴の存在が確認できれば、ポジコンは載せなくてもよい、というふうになるのでしょうか。。？

(無題) 削除/引用 No.11863-4 - 2023/10/20 (金) 00:49:15 - PPP パルミチン酸は直接BSA/PBSには溶けにくいので、一旦DMSOなどに溶かしてから、それをBSA/PBSに希釈するといった方法でやってます。 オレイン酸はBSA/PBSに直接溶解可能です。ただ、50-60度で温めた方が溶けやすかったと記憶してます。 オレイン酸が細胞内に取り込まれているかどうか、Lipid Dropletが形成されているかで確認できます。Lipid Dropletは普通の光学顕微鏡レベルで観察可能です。

(無題) 削除/引用 No.11863-3 - 2023/10/19 (木) 17:57:23 - あの 次の過去スレは？ http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=476

(無題) 削除/引用 No.11863-2 - 2023/10/19 (木) 16:32:43 - decrfgthy 昔はBSAとcomplexを自分で作るのがいろいろ大変で苦労しましたが、今は、脂肪酸-BSA complexの状態で市販されてるものもあったと思います。学生さんが培養細胞への脂肪酸添加の実験を苦もなくやってて、いまはいいなあと思ったので。 探してみてください。

細胞に添加する脂肪酸溶液の作成方法 削除/引用 No.11863-1 - 2023/10/19 (木) 16:07:58 - ぱに はじめまして。いつも参考にさせていただいております。 HepG2細胞に脂肪酸を添加してmRNA発現量を測定しているのですが、どうも脂肪酸の刺激が上手くいっていない？ようなので、質問させていただきました。 現在行っている脂肪酸溶液の作り方は以下のとおりです。脂肪酸はオレイン酸とパルミチン酸です。 1.脂肪酸ナトリウム(シグマより購入)を10 mMになるようにPBSに溶解する。 2.予め作成しておいた12%BSA/PBSと1:1で混合し、フィルター滅菌をする。 3.1回の使用量ずつチューブに分注して−30度冷凍保存。 4.使用するときに溶かして使い切る。(冷蔵保存はしない) 最終的に6%BSAの5 mM脂肪酸溶液になるよう調製しています。脂肪酸を溶かすとき、BSA溶液と混合するときは65-70度くらいに温めています。 細胞に250-750 μMで24時間反応させているのですが、発現量が上がってくるはずのPPARγ、SREBF、PLIN2などの発現量が上がってきません。 PLIN2については、1回目の実験でオレイン酸のみ上がったのですが、2回目では変わらずでした。 今回ソニケーションをしていないため、パルミチン酸はやはり溶けていなかったか。。。と1回目の実験後に考え、作り直す予定ではあるのですが、オレイン酸も上がってこなかったとなると、調製方法に問題があるのでは？と思いました。 しかし、パルミチン酸を添加した細胞については500、750 μMでのアポトーシスが著しく、cDNAの収量も明らかに少ないため、脂肪酸刺激自体はできている気がするのです。 BSA濃度が高くなると細胞への脂肪酸の取り込みが少なくなるというのもありますが、それが原因なのも考えられるのでしょうか？ それとも、パルミチン酸、オレイン酸ともにソニケーションをしていなかったことが原因でしょうか？ 先輩から引き継いだ研究なのですが、脂肪酸の添加には先輩も苦労していたため、同じような実験をしている方や詳しい方がいらっしゃいましたらご教授いただきたいです。 読みにくい文章かと思いますが、よろしくお願いいたします。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---