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(無題) 削除/引用 No.1414-6 - 2013/02/07 (木) 23:45:13 - おお 2倍の差が出た時、2倍の差を評価するのがまず難しいかもしれませんね。実験系にもよるけどmRNAがあがっていて、タンパクも2倍に増えているなら、全体として upregulationはあるだろうというのは受け入れられる場合もあると思いますが、、、厳しいこともあるかもしれません。 まず、あなたのサンプルをそのままと半分量流したのでどの程度さが出ますでしょうか。検出系がX-rayフィルムならシグナルの強さ等々でいろいろ変わって見えると思いますよ。 まあそういう状態のうえ、サンプルの状況で(エイどうのきれいさ、バンド付近のほかのタンパクの量などいろいろなことがパラメーターになりうるので)測定誤差が大きくなったり(ちいさくなったりも)しますので、そういう意味でも2倍は状況によっては難しくなる可能性はあります。

(無題) 削除/引用 No.1414-5 - 2013/02/05 (火) 22:35:05 - TK-1 ２倍程度の差を考えるときに何をコントロールにするかでいくらでも解釈できてしまいます。コントロールは何ですか？一定量のmRNAあたり（例えば18Sなどで代用？）、あるいは細胞数あたり？いわゆる、house keeping gene (Actb, Hprt, G3pdh etc.) などですか？蛋白でも同様です。 薬物で処理したり、細胞の状態によっては、細胞の大きさ、全体の転写量、翻訳効率、いろいろな変化が起こります。ですので、２倍程度を考えるときには何をコントロールに使うかは結構気を使いますが、その辺りはいかがなんでしょうか？ 個人的には、一定細胞数あたりのlysateをつかったウェスタンが一番フェアな比較かと思いますが、mRNAの場合は、、、難しいです。RTの効率とかいろんなファクターが入ってくるので、そう単純にはいかないですが、細胞を溶かす段階で細胞数に応じてspike-in RNAを入れてそれを指標にするというのがベストかと思います。 いずれにせよ、１０倍の差があるものならどんなコントロールと使ってもなにがしかの差が出せるのだと思いますが、その２倍の差が本物かどうかは慎重にすべきかと。

(無題) 削除/引用 No.1414-4 - 2013/02/05 (火) 17:02:53 - STV Westernの結果がmRNAの変化を反映しているかどうかはともかくとして、2倍程度の差でもWesternで検出できるということですので、とりあえず、Westernを進めていこうと思います。 再現性良く２倍の変化が出るようであれば、mRNAの変化を反映しているという結論で進めます。

(無題) 削除/引用 No.1414-3 - 2013/02/05 (火) 15:45:07 - う ＞蛋白質レベル（Western Blot）でみるとそれほど差ははっきりせず、なかなか再現性が取れません。 mRNAの差が２倍だからといって、タンパク質レベルで２倍の差がそのままでるとは限らない、 ということをまず頭に入れておいて、とりあえず、 ウエスタンで「ある一定の結果」が再現性あって出るようにしないと 話にならないのではないでしょうか？ ２倍の差が出るかどうかではなく、どんな結果であれ「再現性のある結果を得る」 それからどうなっているのか考えないと、 一体、何を見ているのかわからないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1414-2 - 2013/02/05 (火) 15:24:00 - み 蛋白レベルで本当に2倍の差があるならWesternで検出できるでしょう。 もちろん腕に問題がないことを前提にしていますが。 あなたの場合、現時点で再現性よく2倍の差があるのはmRNAレベルですよね。 それが蛋白レベルでも2倍の差に繋がっているかは別問題ですよね。 internal controlをいくつか取りつつリピートすれば判断できるでしょう。

Western Blotの感度 削除/引用 No.1414-1 - 2013/02/05 (火) 14:59:43 - STV ある遺伝子の発現を薬剤処理ありなしでmRNAと蛋白質レベルで見ています。 mRNAレベル（リアルタイムＰＣＲ）では薬剤処理ありなしで2倍程度変化があるのがわかりました。 蛋白質レベル（Western Blot）でみるとそれほど差ははっきりせず、なかなか再現性が取れません。 同僚に聞くと、蛋白質レベルでの発現制御があるかもしれないが、そもそも、Westernで２倍程度の差を再現性良く検出するのは難しすぎるというコメントをいただきました。 2倍程度の発現差では、Westernで違いをみることは良くないものでしょうか？

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