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(無題) 削除/引用 No.1705-28 - 2013/05/06 (月) 04:06:45 - おお もうひとつふに落ちないのはターゲッティンぐベクターをつくったなら、薬剤耐性マーカーが2つとかついていて(ネガティブセレクションとポジティブセレクション)どの様にそれが働くか解説を見るだろうし、、、すくなくともマーカーがあることはにんしきするはず。 受精卵にいれたじてんで、マーカーをどのように利用できるのかとか、、、思わなかったのかとか、、、 妄想が膨らみます。

(無題) 削除/引用 No.1705-27 - 2013/05/06 (月) 03:12:57 - おお >[Re:26] Hajimeさんは書きました : > なんとなく思うのですが、質問者様が行おうとしていることは、実際にはトランスジェニックマウスではなくノックインマウスではないでしょうか？ ノックインならESでホモロがすりコンビネーションが起こった細胞をつくってから、胚に注入して、キメラマウスをつくり、キメラからES由来の遺伝子をもったマウスを産ませないとできないですよね、、、たぶん。そうすると実験系が適切でない。

(無題) 削除/引用 No.1705-26 - 2013/05/06 (月) 02:35:06 - Hajime なんとなく思うのですが、質問者様が行おうとしていることは、実際にはトランスジェニックマウスではなくノックインマウスではないでしょうか？ お読みになられている、先行論文を載せてくれれば、どちらのマウスのことを仰られているかハッキリするのですが。

(無題) 削除/引用 No.1705-25 - 2013/05/05 (日) 21:47:05 - 直輝 失礼ながら、質問者さんがトランスジェニックとノックインの違いが分かっていらっしゃるのか、私も心配ではあります…

(無題) 削除/引用 No.1705-24 - 2013/05/05 (日) 20:10:21 - おお まあいいかもしれませんが、何か大きな誤解をされてないかと、、、なので実験系もちゃんと思っていらっしゃるように立てれているのか、、、 それと論文書いてもチャランポランになってしまいそうな、、、 >ターゲティングベクターの作製までは、何とか自力でやり遂げました。受精卵へのインジェクションは終了しており、5月末にマウスが生まれる予定です。 ターゲティングベクターとかかれているのでホモロがすりコンビネーションを考えていらっしゃるようですが、受精卵に導入してそのままマウスをえようとしているので、お考えになっているマウスができる確率はゼロに近いのかと、、、 もしホモロがすりコンビネーションでなくたんに発現ベクターが入ればいいと思っていらっしゃるなら、劣性のホモになるわけでないので、劣性変異体/劣性変異体ってどのようなものをお考えになっているのかと、、、 なにか話がかみ合わないのです。

(無題) 削除/引用 No.1705-23 - 2013/05/05 (日) 18:26:42 - 直輝 No.1705-3 「過去に同じ変異遺伝子のトランスジェニックマウスの報告がありますが、フェノタイプは出ていました（私どものラボでは異なるプロモーターを用いて作製しています）」 No.1705-15 「私が作ろうとしているトランスジェニックマウスに関する先行論文をもう一度見直してみましたが、やはりヘテロで作っていました。」 その劣性変異がどういうものかは知りませんが、過去の論文で劣性変異体のトランスジェニックでフェノタイプが出ていて、その文献の追試になっているんだったら、いいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1705-21 - 2013/05/05 (日) 15:28:41 - おお >[Re:20] くまさんさんは書きました : > >おおさん > > またおかしな事を言ってますかね? > すみません。 >[Re:2] 独り言さんは書きました : > ふーむ。劣勢変異の変異体がトランスジェニックでフェノタイプでるのかなぁ。それともノックインの間違いかなぁ。でも受精卵にインジェクションしたところから、トランスジェニックだろうなぁ。 > ""トランスジェニックなのであれば、ホモにする意味は普通はないし。""

(無題) 削除/引用 No.1705-20 - 2013/05/05 (日) 15:00:20 - くまさん >おおさん またおかしな事を言ってますかね? すみません。 劣性変異体/劣性変異体の意味ですが、ファウンダーマウスと野生型を掛け合わせて生まれたF1同士F1を掛け合わせて、ホモで導入遺伝子を持つ個体を作るということです。

(無題) 削除/引用 No.1705-19 - 2013/05/05 (日) 14:43:01 - おお >もともとは、劣性変異体/劣性変異体を作るつもりでしたが、 ?

(無題) 削除/引用 No.1705-18 - 2013/05/05 (日) 14:07:33 - くまさん お返事が遅くなり、申し訳ございませんでした。 酷い風邪を引いてしまい、寝ていました。 ＞根本的なところで話が通じていないように読めるのですが。 恥を忍んで聞きますが、具体的にどこでしょうか？ ＞Hajimeさん 参考書籍等を教えて頂きありがとうございます。 体調が回復したら読みます（すみませんが、今日はまだフラフラですので最低限のことだけやって帰ります）。 もともとは、劣性変異体/劣性変異体を作るつもりでしたが、ここでお話を聞いて、劣性変異体/wtを作った方がいいのではないかと考えなおしました。 劣性変異体/-は今のところは考えておりません。

(無題) 削除/引用 No.1705-17 - 2013/05/04 (土) 00:51:01 - Hajime http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TransgenicAnimals.html に大まかなやり方が載っています。 Random vs. Targeted Gene Insertionに書かれていますが くまさんが作りたいマウスは 劣性変異体の過剰発現なのか 劣性変異体/wtなのかどちらなんでしょうか？？？？？ トランスジェニックを作ってからノックアウトと書かれているので 劣性変異体/- Hemizygousも考えられているのでしょうか？ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21632/ の Cell-Type-Specific Gene Knockout in Mice Transgenic Mice 項目にもう少し詳しく記載されています。 どのタイプのマウスモデルを作りたいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1705-16 - 2013/05/03 (金) 21:39:59 - 小言幸兵衛 根本的なところで話が通じていないように読めるのですが。

(無題) 削除/引用 No.1705-15 - 2013/05/03 (金) 11:57:11 - くまさん お忙しいところ、私の初歩的な質問に答えて下さりありがとうございます。 私が作ろうとしているトランスジェニックマウスに関する先行論文をもう一度見直してみましたが、やはりヘテロで作っていました。 トランスジェニックって難しいですね。 劣性変異体のトランスジェニックはあまり作られないのでしょうか？ そして、作る場合は一般的にはどのような方法を取るのでしょうか？ ＞劣性にかんしては皆さんの指摘に同意しますが、実は劣性のように見えるがヘテロでは作用がよわいとか、ドミナントネガティブ的だけれども発現量のいきちを超えないとかいうのであれば過剰発言でもフェノタイプが見れるかもしれませんね。 トランスジェニックを作ってからノックアウトとかは大変だし、ヘテロで作ってフェノタイプが出るように祈ります。

(無題) 削除/引用 No.1705-14 - 2013/05/02 (木) 23:51:34 - おお >�Aファウンダーマウスに導入遺伝子が入っているかの確認をPCR及びサザン（外注予定）で行う。 ゲノムに入っているか見るのはひつようですが、ここで蛋白発現もみれるなら楽になるかと思いました。 劣性にかんしては皆さんの指摘に同意しますが、実は劣性のように見えるがヘテロでは作用がよわいとか、ドミナントネガティブ的だけれども発現量のいきちを超えないとかいうのであれば過剰発言でもフェノタイプが見れるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1705-13 - 2013/05/02 (木) 22:37:59 - 直輝 劣"性"変異体でした...

(無題) 削除/引用 No.1705-12 - 2013/05/02 (木) 22:36:28 - 直輝 劣勢変異体というのは、一般的にはタンパク質が機能を失った状態で、もうひとつの遺伝子が染色体にあれば、それで機能が補われるために表現型が出ない（野性型と同じ）ですよね？ だから、トランスジェニックで染色体のランダムな位置に１アミノ酸欠損遺伝子を導入したのであれば、もともとあった遺伝子の方は無傷であり、それで機能が補われてしまうんじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.1705-11 - 2013/05/02 (木) 22:23:37 - くまさん ＞なぜならそれぞれのゲノムの位置が違う可能性があるので、 ゲノムのどの位置に改変遺伝子が入るのかは異なるので、ということですね。 ご指示の通りにします。 いろいろと教えて頂き、ありがとうございます。 複数ラインを取るように言われているので、この場合、A同士およびB同士を掛け合わせるということですね。

(無題) 削除/引用 No.1705-10 - 2013/05/02 (木) 22:11:20 - くまさん ＞Tgで作って、それをノックアウトにかけるんですか？劣性変異体のものならば、endoのものがある限りフェノタイプが出ない気がしますが。 一般的にはそのようなものなのでしょうか。Tg作って終わりのつもりでした。 先行論文ではそれでフェノタイプが出ているのですが…。 ＞あと、Position effect variegationを見るのに組織ウェスタンがどれほど意味があるのか？組織全体として発現しても全細胞に出ないでまだらにしかでないこともある訳です。 全細胞に出ないと生じる問題はどのようなものなのでしょうか？改変遺伝子から生じる異常タンパク質が脳内で悪さをすると考えています。見たい部分は脳なので、まずは脳である程度のレベルが発現していることが重要ではないかと思ったのです。

(無題) 削除/引用 No.1705-9 - 2013/05/02 (木) 22:09:00 - 独り言 ちなみに > �B当たりマウスを野生型と掛け合わせる。 > �C生まれたマウス（F1）同士を掛け合わせる。 この箇所について。 当たりマウスF０を野生型をかけるのはいいのですが、そのあと、F１同士というのは同じラインであるべきす。 例えばF0が5種類(例えばA, B, C, D, E)いたら、それぞれを野生型と掛けて、そのF1を使用してトランスジーンが子孫に伝わり、タンパク質が予想どおり発現し、フェノタイプがでることを確認します。もしAとBが予想通りうまくいって、C,D,Eがうまく行かないときでも、AとBのライン同士を掛けてはいけません。なぜならそれぞれのゲノムの位置が違う可能性があるので、一番いいラインを一つに絞り(Aのみ、もしくはBのみ）、野生型と掛け合わせて維持します。

(無題) 削除/引用 No.1705-8 - 2013/05/02 (木) 21:26:47 - TK-1 Tgで作って、それをノックアウトにかけるんですか？劣性変異体のものならば、endoのものがある限りフェノタイプが出ない気がしますが。あと、Position effect variegationを見るのに組織ウェスタンがどれほど意味があるのか？組織全体として発現しても全細胞に出ないでまだらにしかでないこともある訳です。

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