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(無題) 削除/引用 No.2105-26 - 2013/06/17 (月) 02:29:55 - あひる 皆様 たいへんたくさんのご返答ありがとうございまいた。 お礼が一人一人でなくまとめてになってしまい申し訳ありません。 mon様、AP様、おお様、774様 今私の所属する研究室では染色にエチブロは用いないのですが、 他の所で使うことがあるので勉強になりました。 AA様、774様 ゲルをトレイに流し込む際、少し冷ますことに関して 教えていただきありがとうございました。 よりきれいな泳動像にするため試行錯誤してみたいと思います。 AP様 色素マーカーに違いは特に見られませんでした。 いろいろ教えていただいたことを試し、 もう一度先輩にアドバイスをいただいた結果 ゲル作成の際にGelGreenを入れることで上手くいきました。 染色については、一番最初に染色が弱いという可能性を考え、 染色液と染色時間を普段の二倍にしていたことと、 先輩のゲルで試した時と自分の失敗したゲルは同じように 染色していたが自分のゲルではバンドが見れなかったことから 染色が上手くいっていないのでは…？という可能性は捨てていました。 しかし、おそらく染色に問題があったようです。 これだけたくさんの方にお力を貸していただいたにもかかわらず 原因がゲルづくりではなく染色にあり、非常に申し訳ありません。 今回いただいた意見の中には自分の知らないことが たくさんあり非常に勉強になりました。 中年様のご指摘にもあるように一番は先輩との違いを追求するのが ベストではあったのですが、先輩との作り方に違いが見られず どうしてもわからずこのような場をお借りして質問させていただきました。 本当に様々なアドバイスをありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2105-25 - 2013/06/16 (日) 23:28:46 - 中年 身近に問題なく作業できている先輩の方がいるのだから、ここでああでもないこうでもないと議論するより、その方の作業と違いがあるのがどのステップなのかを徹底的に洗い出そうとすべきなのではないですか。

(無題) 削除/引用 No.2105-24 - 2013/06/16 (日) 19:04:42 - AA なんとなくですが私の経験上、 「熱々のゲルをカセットに広げて固めた場合」 と、 「触れられる程度に冷ましてから広げた場合」 とで、泳動したときの分離の良し悪しに差が出ている気がします。 ・・・・気のせいかもしれません。。。。

(無題) 削除/引用 No.2105-23 - 2013/06/16 (日) 08:17:37 - 774 2%くらいまでしか作ったことはないですが、 トータルの半量のバッファーで電子レンジで溶かして、 透明になったら残りの半量とエチブロを加えてます。 冷えるまでの時間を節約できますし、部分的に固まることもないです。 固まるまでの時間を惜しんでほんのり温かいゲルを使った時に 泳動像がおかしかったことがあります。

(無題) 削除/引用 No.2105-22 - 2013/06/16 (日) 08:06:02 - mon EtBrやCyberSafeは触れないくらい熱い時に加えています。この理由は混合時に生じる泡が消え易いためです。 5~10秒ほど素手で握れるくらいまで冷めたら、ゲルトレイに注ぎます。余分な泡は吸い取るか、端に寄せるか、バーナー式ライターで消します。 3~4%ゲルの場合は、低融点アガロースを半量(eg. 2%+2%)加えると、粘性と不透明感(白度)が下がり、作り易くなります。冷ます時のコツは、頻繁に優しく混ぜ、表面に膜状に固まらせない事です。できてしまったら温め直しか、吸い取るかしてください。

(無題) 削除/引用 No.2105-21 - 2013/06/16 (日) 04:58:28 - おお >[Re:19] APさんは書きました : > EtBrを加えた状態で電子レンジなどで加熱するのを禁忌されるのは > ・突沸した時に周囲が汚染する。 > ・エアロゾルが発生して空気中に広がる可能性がある > ということだと考えます。 > EtBrを異様に怖がるわりに、そういうことには無頓着な人もいるんですかね。 ずいぶん昔の話です。ゲルを再利用したりとか。。。

(無題) 削除/引用 No.2105-20 - 2013/06/15 (土) 23:08:11 - AP ところで質問者さんのシチュエーションでは、色素マーカーの流れ方にはおかしいところはないんですか？（異常に薄くなるとか、色がずれるとか、泳動時間に比して移動距離が短いとか）

(無題) 削除/引用 No.2105-19 - 2013/06/15 (土) 23:01:48 - AP EtBrはそんなに熱に弱いものではないと思いますが（以下に述べる理由から加熱したことはないですが）。 EtBrを加えた状態で電子レンジなどで加熱するのを禁忌されるのは ・突沸した時に周囲が汚染する。 ・エアロゾルが発生して空気中に広がる可能性がある ということだと考えます。 EtBrを異様に怖がるわりに、そういうことには無頓着な人もいるんですかね。

(無題) 削除/引用 No.2105-17 - 2013/06/15 (土) 14:50:58 - おお エチブロは入れて沸騰させる人も昔いました。よほどしっかりした感度が必要な時以外はアンピシリンほど神経質になることはないという気がしますが、もう少し気をつけておけばもっといい感度でけんしゅつできていたかもしれませんけど。 どうしてもうまくいかないなら、オートクレーブ五分ぐらいとか、温度が上がった時点でとまるていどにセットしてとかしたらどう?

(無題) 削除/引用 No.2105-16 - 2013/06/15 (土) 14:13:33 - 独り言 >[Re:11] あひるさんは書きました : > 独り言様 > > 溶かした後私は、50-60℃くらいまで冷まさず > そのままトレイに入れていました。 > コームによって耐熱性でないものは曲がってしまうため > そのコームを使用するときだけ少し冷ましていました。 > その工程は重要なのでしょうか？ > > また染色にはGelGreenを用いており、 > 染色は泳動後に行っています。 エチブロは高温で不活性化してしまうから、冷ましてからいれるんだけど、GelGreenは使った事ないので大丈夫なのかわからんでござる。その先輩がいつも冷ましてから加えているなら大事なはず。

(無題) 削除/引用 No.2105-15 - 2013/06/15 (土) 13:07:34 - あひる ttt様 ご返答ありがとうございます。 濃度が高くなりすぎると泳動に支障がでるのですね。 覚えておきます。 mon様に教えていただいた通りにゲル作成してみたので そのゲルを一度試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2105-14 - 2013/06/15 (土) 13:05:29 - あひる 直輝様 ご返答ありがとうございます。 私の研究室でのプロトコールでは ２％にするために蒸発した分蒸留水を加える となっているのですが、 多少２％よりも高くなっても支障はないのですね。 使用している電気泳動槽に問題はなさそうです。

(無題) 削除/引用 No.2105-13 - 2013/06/15 (土) 13:02:46 - あひる qq様 ご返答ありがとうございます。 バッファー組成についてですが、 私の研究室では５×TBE bufferを0.5×TBE bufferに調整したものを 研究室内で共有し使用しております。 そのbufferを使って先輩のゲルではうまくいったので bufferに問題はないかとおもわれます。

(無題) 削除/引用 No.2105-12 - 2013/06/15 (土) 13:00:09 - あひる mon様 ご返答ありがとうございます。 電子レンジの低出力と高出力ですね。 ご指摘ありがとうございます。 差し水はアガロースを溶かす際に 一緒に別のビーカーに蒸留水を入れて アガロースゲルとほぼ同じ熱さのものです。 かつ、差し水をした後に2回くらいは沸騰させています。 沸騰させすぎるのもよくないのでしょうか？ これでもだめならオートクレーブなのですね。 とりあえずもう少しいろいろ試してみます。

(無題) 削除/引用 No.2105-11 - 2013/06/15 (土) 12:55:11 - あひる 独り言様 溶かした後私は、50-60℃くらいまで冷まさず そのままトレイに入れていました。 コームによって耐熱性でないものは曲がってしまうため そのコームを使用するときだけ少し冷ましていました。 その工程は重要なのでしょうか？ また染色にはGelGreenを用いており、 染色は泳動後に行っています。

(無題) 削除/引用 No.2105-10 - 2013/06/15 (土) 12:50:48 - あひる モモ様 　 ご返信ありがとうございます。 基本的にゲルは１時間以上かけて固めていますが、 固まっていないという可能性も考え訳２時間放置 してみました。しかし結果が変わらなかったので 均一に固まっていないということはなさそうです。

(無題) 削除/引用 No.2105-9 - 2013/06/15 (土) 12:39:18 - 7744 >[Re:3] 独り言さんは書きました : > もしかして、エチブロを沸騰直後にいれて、エチブロが不活性かしているとか。 単純に疑問を持ったので教えてほしいです。 上記内容は本当でしょうか？ 自分の知る限り、エチブロはオートクレーブでも失活されず、失活（という表現は適切ではないかもしれませんが）させるには燃やすしかないと聞いたのですが。 私自身は、普段ゲルを作る時はレンジでチンして、突沸はしないけれど半分沸騰している様な状態でいつもエチブロを入れていますが、全く問題起きたことはないのですが。 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2105-8 - 2013/06/15 (土) 11:16:22 - ttt アガロースゲルは2％以上だと粘性が高くなって対流に支障が出るのか、見た目沸騰してるように見えても完全に溶けてなかったり、固まるのにもムラが出たりしますよね。 monさんのやり方が分かりやすくて良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2105-7 - 2013/06/15 (土) 11:06:15 - 直輝 �Cビーカーにラップのついた状態で重さを測り、蒸発した分と＋α蒸留水を加える。 monさんも言っておられますが、普通こんなことしませんよね。 最初の液量が100mLぐらいあれば、多少蒸発しても気にしなくていい。 2%が2.2%になったって何も問題ないし。 あと質問なのですが、1%ゲルなら問題はおきないんですか？ ところで、使っている電気泳動槽が壊れて、電流の流れ方が変になっている可能性はないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2105-6 - 2013/06/15 (土) 08:19:32 - qq ＞2)バッファーを加える。 ＞同じもので先輩のゲルが上手くできています。 バッファー組成に問題はないのでしょうが、濃度が違うとか？？

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