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(無題) 削除/引用 No.2609-27 - 2013/12/08 (日) 11:20:46 - おお >[Re:26] というかさんは書きました : > というか、質問しているふりをしているだけで、自分の気にいる意見だけを集めているようにみえる。 そこまではいえないんじゃないの。

(無題) 削除/引用 No.2609-26 - 2013/12/08 (日) 08:46:58 - というか というか、質問しているふりをしているだけで、自分の気にいる意見だけを集めているようにみえる。 いろいろな観点をもつべき問題で、様々な重要なヒントを多くの方にいただいておきながら、それに対して考慮をしたとは認められませんから。 研究者うんぬん以前の話ですね。

(無題) 削除/引用 No.2609-25 - 2013/12/08 (日) 04:09:30 - おお >「これこれの実験をやったら、これが分かる。これは分からない。こういう疑問は残る」 これが本質ですね。

(無題) 削除/引用 No.2609-24 - 2013/12/07 (土) 15:25:22 - おお 無知といっているけども質問者は必要なことをほぼすべて知っている上での質問だと思う。なのでどう考えるかの問題でこれを人にいつもきいているようでは研究者にはなれないとおもう。

(無題) 削除/引用 No.2609-23 - 2013/12/07 (土) 13:02:55 - ぺーぺー うーん。なぜ、、、 「これこれの実験をやったら、これが分かる。これは分からない。こういう疑問は残る」 ではなく 「これこれの実験の時、これをやるべき。これはやらなくてよい」 と考えてしまうのでしょう。 細胞数の補正は必要ならやるべきでしょうが、複数の処理において反応性がある処理を探すような実験であれば敢えてやらない場合も多いのでは？ 特に処理前と処理後の比を取る場合で、細胞の密集度と処理前のシグナル強度が処理間でそれほど変わらないのであれば……。 あと少し考えが足りないと思ったのは、ライセートのタンパク質が上清の内部標準になるかと言われれば、ならなくはないけど弱いと感じます。 手技によってブレる可能性は常にあるのですから、例えばWBのシグナル強度が10%あがったので、ELISAの濃度をその分下げますか？ 敢えて補正をかける必要がある、あるいは確認するのに最適な数値があるとすれば生細胞数（全細胞数-生細胞数）でしょう。 それでも、死細胞はIL-8の分泌量に影響を与えないのか、あるいは壊れた細胞から液中に流出されるタンパク質の測定への影響は考えなくていいのか、色々ありますが……。

(無題) 削除/引用 No.2609-22 - 2013/12/07 (土) 12:22:21 - ソクラテスも言ってたよね anoさんの→（自分自身でも少しは考えましょうね。） これを言いだしたら学校もウェブも要りませんね。 人間はみんな無知である。ただ無知な分野が違うだけ。 わからなかったら誰でも良いから聞くことが大事なことです。

(無題) 削除/引用 No.2609-21 - 2013/12/03 (火) 07:21:58 - 太陽が恋しい！ anoさん すいませんいちいち反応するのがめんどくさいのでスルーさせてもらいますけどいいですか？ おおさん、直輝さん、TSさん、SORAさん、まっくろんさん ありがとうございます。 私は実験を初めたばかりなのでそこまでしなくても、という感覚がわからなかったのですが、みなさんの意見をお聞きしておぼろげながら分かるようになりました。 westernで（少なくともハウスキーピングの）タンパク量は揃っているので、その際のELISAでは見る必要がないというのはよく理解できました。westernとELISAしかしたことないですが、その二つの実験には有機的なつながりがあることを理解しました。ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.2609-20 - 2013/12/02 (月) 11:04:10 - まっくろん 　私もTSさんと同じ感想です。また刺激物を加えるような実験で「なぜ目的物が増えたか（減ったか）」を調べる際には，細胞数は押さえる必要があるように思います。ただその際はBrdUの細胞増殖や細胞死も合わせて調べるのことになるかもしれません。その上で，細胞数が変わらないのであれば，じゃあ受容体発現は？とか細胞内の変化は？とかの話になっていくのではないでしょうか。あと，分化誘導のような手順を加えるもので，培養期間が数日にわたるようなものは，一応見るようにはしています。 　上記を前提として，「培養上清のELISAで補正をかけないのに，どうして細胞タンパク質のウエスタンではかけるのか」ということですが，個人的には「同じ量中の目的物を調べる」の「同じ量」が培養上清では「同じ液量」であり，細胞タンパク質では「同じタンパク質量」だからで、「ピペットでの同液量添加」に比べて「細胞タンパク質の抽出→添加」は，手技によるばらつきやミスが起こりやすいからだと理解しています。なのでELISAであっても細胞溶解し回収したタンパク質を見る場合は，細胞数に関係なくタンパク質定量しています。あくまで個人的な意見です。ちなみに最近は私もWBでは総タンパク質で見ています。

(無題) 削除/引用 No.2609-19 - 2013/12/02 (月) 10:41:38 - SORA サイトカインをターゲットとしたELISAは経験したことはないのですが、転写因子などをELISA法を用いて検討したことがありますので、その時の経験を書きますと、 kitのプロトコールにprotein量での補正が必要であることが記されているものもありましたが、特に明記されていないものもありました。 個人的な意見としては、おおさんの言うとおり、明らかに顕著に増加している場合などは特に必要性がないと思いますが、同時に頭打ちの可のせいも考えられるので、特に初めはprotein量を測定して、条件を一定にできるのがいいのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2609-18 - 2013/12/02 (月) 09:46:13 - TS 否定的な意見も出ているようですが、「やりたければ」「必要と感じたら」、細胞数とか細胞タンパク量とかで補正は、特に違和感のない考えと思います。 必要ない（細胞数とかにばらつきがない）と感じる実験は多いと思いますが。 ウェスタンでも、１つのハウスキーピングタンパクだけでなく、総タンパク量で補正するというやり方もありますよね。 最近、私もb-actinなどよりも好んでその方法をとっています。

(無題) 削除/引用 No.2609-17 - 2013/12/02 (月) 09:13:54 - おお 気になるなら、各wellの写真を見やすい大きさで写真で数枚とっておけばいいかと思います。DAPIなどで染色するとなおいいかもしれません。写真をしめすだけで、細胞数に大きな差がないといえる場合もありますす、万が一必要になったら、一定エリアの細胞数を数えて相対的細胞数の変化を示せますから。DAPIでとると、イメージングソフトでうまくやればカウントしてくれますよね。あるいは一定エリアのDAPIシグナル強度でもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2609-16 - 2013/12/01 (日) 19:44:04 - 直輝 Western Blottingなら抗体が１種類増えるだけだけど、ELISAだと全く別実験で細胞数を測定する必要があるからやらないんだと思う。特にサイトカインの産生とかだと、細胞は播種数のばらつき以上の変化があるはずなので、わざわざ半日潰して細胞数を補正するほどの必要性を感じません。 Western Blottingにしても、私はbeta actinは普段はやりません。論文掲載用のデータを取る時はやりますが、そんなにばらついたことはないです。 もし細胞の少ないウェルがあったとして、beta actinでウェスタンしてなくても、p38/リン酸化p38の比を見れば気がつくと思う。

(無題) 削除/引用 No.2609-14 - 2013/12/01 (日) 16:58:36 - ano まず考えるべきポイントは、”細胞数だけ”が、分泌量の決定要因と見なせるかどうかでしょうね（LPSの受容体との結合から分泌量の変化までの経路）。 また求められる、データの精度がどの程度で、精度を高めるための手間やコストなども考えるべきでしょう。 ただし、細胞数などの要因の効果を無くすためには、同じ試験物の同じ濃度を３〜４の培養ウェルを用いて反復測定して、平均値を算出するという方法が一般的だと思うけど、そちらでは、１つの培養ウェルしか使っていないのでっか？ 以上の点、よくよく考えて、お好きにすれば、よろしいかと。 もし細胞数が重要な場合は、単位は、ng/cell/mlにした方がよいかもね。 （自分自身でも少しは考えましょうね。）

(無題) 削除/引用 No.2609-13 - 2013/12/01 (日) 13:55:00 - おお アプローチの仕方がいろいろあると思いますが、遺伝子レベルで上がっていて、それが生理的な意味がいえるかみるためにELISAをやるなら、5、6倍出ているとかであれば、まあよほど顕著な細胞数の差がない限り、突っ込まれないかもしれませんね。LDHや簡素化した細胞数(活性)測定法があるのでそう言うので補正する方が望ましいですね。

(無題) 削除/引用 No.2609-12 - 2013/12/01 (日) 12:54:02 - 太陽が恋しい！ anoさん 相対的な変動を見るので単位を気にする理由がわからないのですが、なぜそう思われるのか ''考えてもわからないので’’ 逆に教えて欲しいです。 おおさん、細胞さん そうなんです。コントロールはDMSOで、LPSと同じ時間処理しています。 LPS処理時の細胞数の変化などは実際に測定していないので、それをしないとまずいんちゃうかあ？と思ってるんですが、なぜしなくても良いと言われるのかが理解できませんでした。 おおさんや細胞さんが言われるようにやはり細胞の溶解液を作成して、生細胞数の相対的な変動を補正した方がいいですよね！ある論文では、分泌タンパク質の発現上昇を言うためにLDHを測定して細胞死の可能性を排除したり、細胞溶解物を作成してハウスキーピングをみていましたので、そう示されると納得できたというものです＾＾

(無題) 削除/引用 No.2609-11 - 2013/12/01 (日) 11:09:26 - 細胞さん > ng/mlなどで表示するのがスタンダードである濃度は、どういう単位で表示するのですか？ 刺激後の時間が数時間や1日程度なら影響ないでしょうけど、数日培養するとか細胞毒性があるとかの場合は細胞数で比較すべきだと思いますよ。 細胞数の変化に比べれば培地の量の変化はそんなに大きくないから、培地の量は既知なのでng/cellに変換することは可能ですよね。

(無題) 削除/引用 No.2609-10 - 2013/12/01 (日) 10:58:55 - おお >[Re:9] anoさんは書きました : > ng/mlなどで表示するのがスタンダードである濃度は、どういう単位で表示するのですか？ 相対量であれば単位はきにしなくていいですよ。

(無題) 削除/引用 No.2609-9 - 2013/12/01 (日) 09:53:01 - ano 根本的によく考えてみなさい。 "細胞培養液のELISAを行う時に、細胞を溶解してその総タンパク質量を求、、、” 細胞の外の濃度を、細胞内のなんらかの指標で補正してどうするんですか？ ng/mlなどで表示するのがスタンダードである濃度は、どういう単位で表示するのですか？

(無題) 削除/引用 No.2609-8 - 2013/12/01 (日) 09:41:28 - おお WBも一度蛋白量をそろえてしまえば、アクチンを見る必要はあまりなくって、実際アクチンは見るけど補正せずに定量することもありえます。あるいは見ないでそう蛋白がうまくトランスファーされていて、そろっている事をPonceauなどの染色でしめしすというのもありです。なのでWBでそもそもなんで条件で変動するかもしれないハウスキーピングgeneをわざわざしめしてややこしいことをするのかというのは私もおもいます。 それでも示すのは場合によってはほかの理由もあるのですが。

(無題) 削除/引用 No.2609-7 - 2013/12/01 (日) 09:33:15 - おお 培養液のターゲット(IL-8)の濃度が2倍になったとき、細胞が二倍になっているんじゃないと突っ込みがいれれる状況なら補正が必要ですね。まあアクチンでwbするより、蛋白量などでやるほうが無難だと思いますけど。それか細胞数をカウントするか。

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