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(無題) 削除/引用 No.3744-23 - 2015/01/22 (木) 04:05:32 - おお DEAEより強いQはお持ちでないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3744-22 - 2015/01/21 (水) 14:03:22 - BD ご指摘ありがとうございます。 勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.3744-21 - 2015/01/21 (水) 13:40:08 - BD 培地中に含まれる低分子化合物の阻害について理解致しました。 ご指摘ありがとうございます。 脱塩か簡易精製が必要なこと、理解したのですが、どのようにしたら良いか考えているところです。

その後 削除/引用 No.3744-20 - 2015/01/21 (水) 13:38:15 - BD 陰イオン交換カラムで簡易的に精製することを試みましたが、うまくいきません。 やり方が悪いのか、陰イオン交換カラムの使い方がおかしいのか...。 もし、ご教授願えましたらお願い致します。 タンパク質AのpIが5付近でしたので、pH6になるようにリン酸Bufferを添加しました。 その後、DEAE-sepharoseカラムに、培養液全量を流してカラムへの吸着を試みましたが、吸着せず、全てフロースルーに出てしまいました。 pH 7や8にも調製してみましたが効果有りませんでした。 培地中の成分の影響で上手く吸着しないのでしょうか？ ラボの事情により大量の培地を透析出来る透析膜が購入出来ず、手持ちの陰イオン交換カラムで何とか濃縮しようと考えております。 何かしらの手だてを考えられましたらご教授願えますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3744-19 - 2015/01/16 (金) 10:23:22 - yyy 自分の専門分野の習慣から、「タンパク質」と言うのは「糖」vs「糖質」みたいな、栄養素を表すときの集合名詞的なもので、個々の種類のproteinを日本語で表現するのは「タンパク」(e.g. C反応性蛋白)だと勝手に思っていましたが、どうやらそういうこともないようですね。 好きな方を使って良いようです。

(無題) 削除/引用 No.3744-18 - 2015/01/15 (木) 20:36:04 - だい > pH5, 6に調製出来ることは確認しております。 ?? http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1406

(無題) 削除/引用 No.3744-17 - 2015/01/15 (木) 15:46:01 - おお ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2909483/ Three different methods can be used to elute the tagged protein of interest. Lowering the pH (to 5.3–4.5 for Ni2+–NTA, 6.0 for Co2+–CMA) protonates the imidazole nitrogen atom of the histidine residue (pKa 6.0) こちらでは5ぐらいまでさげてますね。 6強で溶出するプロとコールもあったけど、、、 ttp://www.clontech.com/US/Support/Applications/Tagged_Protein_Purification/Ni-NTA_Resin_vs._Talon これなんかそうですね。レジンよっても挙動が違いますね。一度予備実験をしてbestな条件を見つけるのがよさそうです。 EDTAなんかも溶出に使えますが、Niもカラムからはがれて落ちてきてしまいます。カラムはあとでNiをチャージできます。

(無題) 削除/引用 No.3744-16 - 2015/01/15 (木) 15:44:50 - え >[Re:11] yyyさんは書きました : > 単一のタンパクを指すのに「タンパク質」という言い方はやめた方が良いです。 > 「脂質」などのように一般を指す言葉です。 言いたい事がよくわかりませんが、特定のタンパク質でもその他一般のタンパク質でも、タンパク質で問題ないのでは。 むしろ「タンパク」という表記は「タンパク質」の略式表記で、あまり好みません。 それとも「タンパク質A」とか表記しろということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3744-15 - 2015/01/15 (木) 15:24:52 - BD yyyさんご指摘ありがとうございます。 「タンパク質」という表現以外に何が適当だと思われますか？ 余り詳細を表記出来ないのですが、分解・合成のような活性を持つ「酵素」でも無く、生理活性物質でもありません。故に「タンパク質」という表現を用いていたのですが...。

(無題) 削除/引用 No.3744-14 - 2015/01/15 (木) 15:22:26 - BD おおさんご指摘ありがとうございます。 確かに脱塩カラムですと出来ない実験であることに気付きました。 このため、陰イオン交換カラムで濃縮と簡易精製を行い、陰イオン交換カラムの溶出溶液をpH 8.0にシフトさせた後に、His-trapカラムを用いて精製しようと思います。 不勉強で申し訳有りませんでしたが、イミダゾールを含まない酸性バッファーで溶出出来ることを初めて知りました。私の取り扱っているタンパク質？はイミダゾール存在下で不安定な性質があり、His-trapカラムで溶出後、迅速に透析でイミダゾールを除去する必要が有りました。 イミダゾールを使用せずに精製出来るならば、こちらの方が利点が多いです。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3744-13 - 2015/01/15 (木) 15:07:43 - おお >または脱塩目的のゲル濾過 それも一案だと思いますよ。でもあえて透析といったのは、カラムのスケールがかなりでかくなるんじゃないかと、、、培養液の5-10倍のvolume のカラムをつかわないと。 そう言う意味ではカラムに持っていくならイオン交換とかヘパリンとかhapとかじゃないかなとおもいます。きっちりした精製ならやはりカラムのvolumeは重要なんですが、くっつけて外すには目的の蛋白が全部くっつていどのゲル(レジン)があれば十分ですから 。 前にやってたいとはうまくいってたんですね。pH7強のバッファーで薄めてたんだろうか、、、

(無題) 削除/引用 No.3744-12 - 2015/01/15 (木) 14:56:34 - おお そうですねぇ、、透析は時間がかかりますから不安定だったら向いてないかもしれませんが、、、pH7.5ぐらいのプロとコールが示されているものもあると思います。どうしてももっとアルカリにさらす時間を減らしたいなら透析はphosphate bufferで酸性でやって、カラムにかける直前に2カリか2ナトのリン酸でphを7.5以上に上げてやる手はあります。リン酸だと目的のpHになる混合比がtableで手に入りますのでpH調整が楽です。でも一度まぜたあとにpHは確認するべきでしょう。 アルカリ側のpHで結合させて酸性pHのバッファーで溶出することも可能です。pH6.5とかでも落ちてくると思います。まあそのpHで念のためいみだぞーるいれてもかまいませんし。もちろんもっと極端にpHを下げてもかまいませんけど。

(無題) 削除/引用 No.3744-11 - 2015/01/15 (木) 14:53:28 - yyy 単一のタンパクを指すのに「タンパク質」という言い方はやめた方が良いです。 「脂質」などのように一般を指す言葉です。

(無題) 削除/引用 No.3744-10 - 2015/01/15 (木) 14:47:22 - BD バッファーを加えた後のpHは確認しております。 終濃度で100 mMのバッファーを添加するとpH5, 6に調製出来ることは確認しております。 培養器の問題で100 mL以上の培養は難しいのが現状です。 また、かつてはこの条件で数mgのタンパク質が取れていた記録が有ります。 私が行っても培養液中のタンパク質量をSDS-PAGEで比較すると前任者の時と同程度のタンパク質生産性を示しております。 前任の先輩がタンパク精製に詳しい方だったので、当たり前の事として行っていた何か？が欠落して回収率が上がらないものと考えておりますがいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3744-9 - 2015/01/15 (木) 14:36:37 - bc > pH 8.0のバッファー有りますので早速試してみようと思います。 > > 現在、培養液に終濃度 100 mM程度になるようにバッファーを添加してpHを調製 この辺りの書き方が少し気になりましたが、バッファーを加えた後、pH測定はしているのでしょうか？ 培養液の全量は100 mLなら頑張れば10倍とか100倍培養可能？？そういう問題ではないか。

(無題) 削除/引用 No.3744-8 - 2015/01/15 (木) 14:23:12 - BD ありがとうございます 先輩に相談したところ、アルカリpHでは不安定になるタンパク質ということでpH8に直前にしてカラムに通しては？という意見を頂きました。 His-tagの結合を阻害する成分を除去したいと思っているのですが、有効な対策有りませんでしょうか？ 例えば、非常に低濃度の酸性バッファーで透析を行い、透析サンプルをpH8にしてHis-tag精製し、溶出したタンパク質を再度酸性pHのバッファーで透析する...というのは有効だと思いますか？ または脱塩目的のゲル濾過を行うか...。いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3744-7 - 2015/01/14 (水) 16:42:25 - おお 透析でバッファー置換もできるしpHを8にしたいということで培地に何か加えてpHを調整するよりめりっとがあるということです。

(無題) 削除/引用 No.3744-6 - 2015/01/14 (水) 16:31:52 - おお 単純にその蛋白を含む培地を透析すれば懸念のアミノ酸とかを除くことができるでしょといってます。別にワンステップかましてもいいですけど、それは好きなようにしてください。

(無題) 削除/引用 No.3744-5 - 2015/01/14 (水) 16:23:06 - BD 例えば、陰イオン交換カラムや硫安沈殿・透析を一度行い、簡易的に精製した後に、His-tag精製すべきとのご指摘でしょうか？ アドバイスありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.3744-4 - 2015/01/14 (水) 15:39:33 - おお >培養液ということなのでアミノ酸など結合を阻害するものがいろいろありそうな気がします。 培養液ということなのでアミノ酸などHis-tagのNiカラムへの結合を阻害するものがいろいろありそうな気がします。

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