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(無題) 削除/引用 No.4450-27 - 2015/10/03 (土) 11:34:49 - tana 他の人も書かれてましたけど、要所々々の試薬は指導者が準備したものを使っているようですね。 その結果、Sample bufferの組成とか抗体の詳細が不明なまま。 これじゃ原因の追求は無理っぽい。 ここに書かれている情報だけだと、指導者も試薬の準備を学生にやらせず自分でするという 過保護？っぷりなのに、うまくいかなかったら突き放すというヘンなひとのようだし。 それとも、試薬の詳細について学生が自分から聞きに来るのを待っているとか？

(無題) 削除/引用 No.4450-26 - 2015/10/03 (土) 11:07:44 - おお タンパク質があまり発現してなかったという結論をだすほど確実なデーターがとれてないとも思えますけど

(無題) 削除/引用 No.4450-25 - 2015/10/03 (土) 09:13:00 - Hg38 タンパク質があまり発現していなかったということで 別の実験系を組み立てます。僕なら

(無題) 削除/引用 No.4450-24 - 2015/10/02 (金) 07:51:59 - おお プロテアーゼの不活化もSDSを加えたときに直ちにやりたいので熱処理したんだと思います。まあありかなぁと思いますけどね。

(無題) 削除/引用 No.4450-23 - 2015/10/02 (金) 07:04:18 - しろ >[Re:7] ゆうさんは書きました : > 簡単なフローとしては。 > 細胞を2×sample bufferで溶解させチューブに入れ、すぐさま表情に移動。こちらの2×samplebufferの組成ですが、確認させて頂きます。ただSDSが入っていて、2MEは入っていないと言うのは指導者から聞きました。その後98度で5分ヒートブロックし、超音波で細胞溶解液をサラサラになるまで処理する。タンパク定量には蒸留水、BCA溶液、調べる細胞溶解液、標準タンパクであるBSAを用いてABS562nmにてタンパク定量しています。　SDS-PAGEですが、アクリルアミドゲルの濃度は12.5％を選択しました。泳動サンプルを使用する際はトータルタンパク質量が20μgになるようにトータル液量16μlで、5×samplebuffer　with 2MEを1×になるように希釈し、高純度水、細胞溶解液を混合させ、5分98度でヒートブロックしました。その後アプライし、 細胞溶解液をヒートして、超音波してから定量し、サンプルバッファーと2ME混ぜてまたヒートして流したということですか。（ヒート2回？）うちではオンアイスで超音波して、ヒートは泳動前にサンプルバッファーと2MEを混ぜたときの1回なので。

(無題) 削除/引用 No.4450-22 - 2015/10/02 (金) 05:29:28 - しろ >[Re:17] ゆうさんは書きました : > 抗体やタンパク定量などでのトラブルを思考していましたが、どうやら違うようです。実験技術や方法でのトラブルではないと指導者にバッサリ言われました・・・。 > だとすれば、細胞をＧ１で停める必要があったが、停めずに実験を行ったために、サイクリンＤ１が分解してしまっていた。くらいしか考え付きませんが・・・・ 先ほどは実はトピック内容をよく読まずにコメントしてしまったのですが、全体を見ますと抗体やバッファーなどの調整はほとんど指導者さんが作ったものをもらって使用されているようです。それを怒っているとかないでしょうか・・・あと、 倍加時間が遅い細胞のため、3日培養にしたのがサンプルとして使用するのに短すぎたという可能性もありますでしょうか？ これもあるような気がしますね。

(無題) 削除/引用 No.4450-21 - 2015/10/02 (金) 03:43:13 - おお 蛋白量は具体的にこれぐらいのスケールだとどれくらいとか、ECLか蛍光かとか具体的な話はみんなスルーされちゃうのね。。。 研究の判断のしどころというのはいろいろな種類のものがあって、今回ボスがどの様な判断をしたかわかりません。この系で検出できないならそれ以外の系は今の環境ではできないので、やめておこうとかそれだけのことかもしれません。すなわち結論を得る以前の問題。 まあいずれにしろもうちょっと説明してくれればとはおもいますが、それとも説明しているけど伝わってないのか、、、 蛍光での検出はいまのケミルミによる検出より検出感度が低いとおもいます。なので検出したければ検出系をいじる手はあるんですよ。

(無題) 削除/引用 No.4450-20 - 2015/10/02 (金) 00:35:39 - しろ 私でしたらとりあえずポジコンを流してみて、バンドが出るかどうかの確認を最初にしますね。もし指導者さんが同じ過去にしていたなら、その使用したサンプルと結果の写真があるといいですね。それで同じように出なければゆうさんのウエスタンの手技、あるいは抗体がよくないとわかりますし、出ればゆうさんの細胞処置の方法あるいはサンプル調整の手技があやしい、とバンドが出ない原因がしぼれますよね。指導者さんが「それ以前の問題だ」ということは、細胞処置方法あるいはそのときの細胞のコンディションに問題があると考えたのでしょうか。やっぱりすでに報告されている別の細胞でもその試薬を試してみてウエスタンで確認したほうがいいような気がします。「私の手技が悪いのかもしれないので倍加時間が遅い細胞を使う前に別の細胞で練習したい」でやってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4450-19 - 2015/10/01 (木) 16:23:24 - たていす ＞くらいしか考え付きませんが・・・・ くらいしかとは、軽いねぇ？ 楽天主義も研究にめげない資質としては重要かもしれない。

(無題) 削除/引用 No.4450-18 - 2015/10/01 (木) 15:44:16 - おお 検出感度以下だっただけじゃないの。

みなさま 削除/引用 No.4450-17 - 2015/10/01 (木) 15:22:33 - ゆう 抗体やタンパク定量などでのトラブルを思考していましたが、どうやら違うようです。実験技術や方法でのトラブルではないと指導者にバッサリ言われました・・・。 だとすれば、細胞をＧ１で停める必要があったが、停めずに実験を行ったために、サイクリンＤ１が分解してしまっていた。くらいしか考え付きませんが・・・・

(無題) 削除/引用 No.4450-16 - 2015/10/01 (木) 12:38:23 - たていす ＞一次抗体の由来は教えて頂いてませんが。 あなたは抗体をどうやって貰っているのですか？ 抗体のチューブには、メーカー名や製品番号は書かれていないのかなあ？ それとも予め適当に希釈された抗体を渡してもらっているのかなあ？以前の大学院生のレポートも見てみましたか？ 検出方法は、ECLのような化学発光ではなくLICORのような蛍光検出なのですね？ケミルミネッセンスを蛍光と誤用している学生さんが比較的多いような気がすので念の為です。 蛍光検出だとすると、膜やブロッキング剤の組み合わせが、ケミルミとは異なるかもしれませんね。 仮に蛍光検出しているのだとすると、PCNAとcyclin-Dを同時検出している可能性もあるかもしれませんが、どうなのかなあ。

(無題) 削除/引用 No.4450-15 - 2015/10/01 (木) 12:12:35 - おお >35mm dishに85％Confluence これなら細胞の種類やconfluentの状態の感覚にもよるけど数百マイクログラムはとれるのでは。 たとえば1mlのbufferにけんだくすると濃度はまあ少なく見積もっても0.2mg/mlとかありそうですけど、そのはんいならBCAではかれそうだけど。 それがはかれてないとすると、なにか変です。

(無題) 削除/引用 No.4450-14 - 2015/10/01 (木) 12:02:37 - おお サイクリン用とかいっている段階で情報が不足しすぎているとしかいいようがないのですが、、、一次抗体の動物種とか、抗体の種類とか他の動物に対しての交差性とかいろいろありすぎて答えられません。 場合によってはバックグランドやシグナルの直線性などの都合で同じ2次抗体でも1次抗体によって濃度を変えたりしてるかもしれませんし、 そんな不確かなところばかり考えても答えが出ないですよ。

小言幸兵衛さま 削除/引用 No.4450-13 - 2015/10/01 (木) 11:33:44 - ゆう 2次抗体の取り間違えが検出不良を引き起こすのはもちろん承知しております、が最悪の場合の答えです。 ですが、PCNAの2次抗体をサイクリンD1に使って、サイクリンD1の2次抗体をPCNAに使って、PCNAだけが目的バンド検出出来ることって起こり得るのでしょうか？今回は同じメンブレン上でPCNAだけが検出されました。

(無題) 削除/引用 No.4450-12 - 2015/10/01 (木) 11:24:58 - 小言幸兵衛 > 2次抗体を取り間違えて反応させてしまった場合、PCNAだけが正常に目的バンドが検出できて、cyclinD1が検出できないということは起こり得ますでしょうか。 ２次抗体を取り違えていたらそりゃ検出できませんよ。

小言幸兵衛さま 削除/引用 No.4450-11 - 2015/10/01 (木) 11:15:27 - ゆう 私みたいなレベルの人間が言うのも何ですが、仰る通りですよね。指導者は学生に全てを投げるタイプで、あとは知らないふりというように見受けられます。なので現在この問題とストレスもあって、かなり精神的に参っています。

(無題) 削除/引用 No.4450-10 - 2015/10/01 (木) 11:10:39 - 小言幸兵衛 盲検でもないのに材料や試薬についての情報を与えないまま実験させようとするなんて、指導者として大いに問題あり。

おお様 削除/引用 No.4450-9 - 2015/10/01 (木) 10:47:59 - ゆう 細胞数ですが、35mm dishに85％Confluenceで細胞回収をしております。 BSAはlysateにつかったbufferで希釈をしている状態です。今回、記述したように1枚のメンブレンを分けてPCNAとcyclinD1を見ています。その際、一次、2次抗体を指導者に作り置きをしてもらっていました。2次抗体を取り間違えて反応させてしまった場合、PCNAだけが正常に目的バンドが検出できて、cyclinD1が検出できないということは起こり得ますでしょうか。一次抗体の由来は教えて頂いてませんが。

(無題) 削除/引用 No.4450-8 - 2015/10/01 (木) 01:34:35 - おお 細胞の数がわかるような何か具体的なものを提示していただけませんか。 たとえば60mm dishで50% confluencyとか、細胞を何個まいたとか。 BCAはbMEやDTTが入ってなければたいていは大丈夫でしょうけど、グリセロールが若干バックグランドを押し上げると思います。2xだと20%ぐらいでしょうか、、、わたしがつかっているBCAキットはマニュアルには10%までと書かれてたとおもいます。1xで調整しても十分じゃないでしょうか。あるいは1%SDS in PBSのようなものでも十分です。BSAはlysateにつかったbuffer(今回は2xSample bufferだとおもいますが)で希釈してますでしょうか。バッファーの影響で下駄をはいたりするのを解消しないといけないので。まあサンプルがげたを履くと多く見積もられてしまいますので、今回とは逆かもしれませんけど。

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