BioTechnicalフォーラム [ウエスタンで見えるはずのものが見えない]

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おお様

No.4450-7 - 2015/10/01 (木) 00:16:15 - ゆう

わたしも蛋白量解決を指導者に考案したのですが、記載の通り、それを考案する以前の問題だと却下されました。。
抗体のメーカーですが、指導者から無言で渡されたので詳しくは確認できていませんが、アブカムのものです。内在性サイクリンD1を認識するものなのですが、品番は確認できていません。
簡単なフローとしては。
細胞を2×sample bufferで溶解させチューブに入れ、すぐさま表情に移動。こちらの2×samplebufferの組成ですが、確認させて頂きます。ただSDSが入っていて、2MEは入っていないと言うのは指導者から聞きました。その後98度で5分ヒートブロックし、超音波で細胞溶解液をサラサラになるまで処理する。タンパク定量には蒸留水、BCA溶液、調べる細胞溶解液、標準タンパクであるBSAを用いてABS562nmにてタンパク定量しています。　SDS-PAGEですが、アクリルアミドゲルの濃度は12.5％を選択しました。泳動サンプルを使用する際はトータルタンパク質量が20μgになるようにトータル液量16μlで、5×samplebuffer　with 2MEを1×になるように希釈し、高純度水、細胞溶解液を混合させ、5分98度でヒートブロックしました。その後アプライし、Running bufferを用いて泳動を行ない、セミドライ式ウエスタンを実施しました。ちなみに同条件でcyclinD1とPCNAを見る用に1枚のメンブレンに泳動転写したのですが、PCNAは正常にバンド検出できましたが、cyclinD1だけが検出できませんでした。

Tana様

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No.4450-6 - 2015/09/30 (水) 23:58:27 - ゆう

回答ありがとうございます。頂きました質問ポイントに関して回答させて頂きます。

1.細胞から抽出するlysis bufferは適切か。
細胞は指導者が調整、指示した2×sample bufferを使用しているので適切だと思われます。

2.Lysis bufferにProtease inhibitorを加え忘れていないか。
こちらも指導者が調整時に配合しているとのことです。

3.サンプルバッファーで細胞回収した、とあるが、泳動用のサンプルバッファー（Laemmli buffer）でlysisしているなら、SDSと還元剤の影響でタンパク定量ができていないのではないか。
泳動用とは別のものを使用しています。タンパク定量はBCA定量法にて今まで行っておりました。
今まで他細胞で同様に細胞回収して定量、ウエスタンを行ってましたが、今回のようなイレギュラーは初めてです。

4.抗体に問題はないというのは、一次抗体に関してだけのことで、二次抗体の組み合わせは適切か。
こちらも組み合わせ確認をしておりますが、適切な選択だという事です。

5.蛍光検出とあるが、蛍光ラベルしている二次抗体を用いているのなら、フィルターの設定はあっているのか。
フィルター設定も全て正確な設定にて蛍光検出していることを確認しています。

試薬絡みの問題ではない可能性が高いですね...。

(無題)

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No.4450-5 - 2015/09/30 (水) 23:53:12 - おお

ああ、そうですね。各ステップどの様にやったのかbufferの組成などを書いてくれればいろいろ考えられなくもないですね。ちなみにその抗体はどこの何という抗体でしょうか?

(無題)

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No.4450-4 - 2015/09/30 (水) 23:49:07 - おお

まずは蛋白量を解決すればどうですか?その上でポジコンを加えることは意味がないといいません。その細胞で発現しているのかはわからないならばとくに。繊維芽細胞などで通常のgroth mediaで飼っている状態で経験的には十分ECLで検出が可能でした。使ってた抗体はサンタクルーズからかったものだったと思いますが、どれかというところまでは覚えていません。

(無題)

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No.4450-3 - 2015/09/30 (水) 23:35:20 - tana

指導者とのディスカッションが不足しているのかもしれない、というか指導者はこういうところで質問して解決するのではなく、自分で文献等を調べることを望んでいるようなきがしないでもありませんが、暇だったので。

1.細胞から抽出するlysis bufferは適切か。

2.Lysis bufferにProtease inhibitorを加え忘れていないか。

3.サンプルバッファーで細胞回収した、とあるが、泳動用のサンプルバッファー（Laemmli buffer）でlysisしているなら、SDSと還元剤の影響でタンパク定量ができていないのではないか。

4.抗体に問題はないというのは、一次抗体に関してだけのことで、二次抗体の組み合わせは適切か。

5.蛍光検出とあるが、蛍光ラベルしている二次抗体を用いているのなら、フィルターの設定はあっているのか。

投稿者です

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No.4450-2 - 2015/09/30 (水) 22:07:03 - ゆう

失礼致しました。細胞培養日数に誤りがありました。
細胞培養日数は6日になります。これは35mm dishに播種しています。3日と言ったのは、Cyclin Dの活性を抑制させる遺伝子を強制発現させる薬剤を投与してから3日目という意味です。細胞自体は6日培養です。

ウエスタンで見えるはずのものが見えない

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No.4450-1 - 2015/09/30 (水) 21:47:45 - ゆう

こんばんは。現在大学研究室で細胞を用いて実験を行っています。ある問題が発生しており、様々な論文を読み、解決のための情報を調べてみましたが、どうしても解決方法が分からず、指導者に聞いてもアドバイスを貰えず、皆様に助けて頂きたく書き込みをさせて頂きます。
現在、研究を進めていく中で、神経モデル細胞内に発現しているcyclin D1をウエスタンで蛍光検出する実験操作を行っています。ですが、目的分子量の位置にも他の位置にもバンドは確認できませんでした。ちなみに用いている細胞は倍加時間が37時間と遅めの細胞です。これを3日間培養したものをサンプルとして、細胞に何も施していない素の細胞抽出物、cyclin D1の活性を抑制するであろう働きのある遺伝子を過剰発現させる試薬を二種類の濃度で投与し培養した細胞抽出物をアプライ泳動しました。何も処理していない細胞は通常に増殖をしていたため、少なくともバンドは検出出来るはずだと予想していました。マーカーは綺麗に転写されていました。神経細胞は3日培養して、9割に増殖したものをサンプルバッファーで細胞回収したものを使用しています。抗体は指導者が適切な条件で希釈、選出して下さっているので、恐らく抗体には問題ないかと思います。
指導者にポジティブコントロールを流して泳動していなかったので再度ポジティブコントロールを一緒に泳動して実験することを提案すると、意味がないと返答され、私が最後の答えとして、泳動に用いたサンプルのタンパク質量が検出感度以下のタンパク質量だったためにバンドが検出できなかった可能性を話すと、それ以前の問題だと言い放たれました。実験操作におけるミスは思い付きませんし、転写不良の可能性も低いですし、検出感度以下のタンパク質量を原因として考えるそれ以前の問題が何なのか困惑しています。一体何が問題の可能性があるのでしょうか？
倍加時間が遅い細胞のため、3日培養にしたのがサンプルとして使用するのに短すぎたという可能性もありますでしょうか？どうか私を助けてください。

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