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(無題) 削除/引用 No.5448-14 - 2016/10/06 (木) 15:42:47 - 亀子 たていす様 Sfi Iの配列は確認しており、インサートとベクターで同じ配列になっています。ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5448-13 - 2016/10/06 (木) 15:29:13 - たていす No.5448-9でmonさんが指摘されていますが、 SfiIの切断配列はGGCCNNNN/NGGCCですから、切断した断片の突出配列は同一とは限りません。 NNNN/Nの部分（の中3っのN）がベクターの配列とインサートの配列が同じでないと、ligationできませんがご理解されていますよね。

(無題) 削除/引用 No.5448-11 - 2016/10/06 (木) 12:26:58 - 亀子 たくさんのお返事ありがとうございました。 ライゲーションに用いるベクターとインサートの濃度を上げ、短時間でライゲーション後電気泳動で確認してみて、また結果を報告します。

(無題) 削除/引用 No.5448-10 - 2016/10/06 (木) 00:08:12 - おお PEGについては最近はキット化のせいか濃度や量が固定されたような感覚で使っている方も多いと思いますが、インサートの量やプラスミドの濃度などにも依存するのかと思います。高分子のDNAができてしまうのは環状にならないというのも原因の一つなので何らかの都合で線上のライゲーションも起こりやすい条件になっているのかと思います。 全くコロニーが出ないのはさすがに経験したことはないのですが、やはり濃度とか条件次第だと思いますし多少コロニー数が減ってもポジの割合が増えるならコンストラクションで一種類のプラスミドをえるにはそちらのほうが有利ではあります。ライブラリーなどを考えているなら特に気を使わないと行けないかもしれません。 Ligationにかんしては monさんがしてきしていますように電気泳動で見れる十分量使ってください。ライゲーションによりバンドが分散するのでそれぞれのバンドの濃さは薄くなると思います。濃度が問題なら容量を増やしてエタ沈すればいいです。凍結乾燥はいろいろなものが濃くなったりpHが変動したりであまりおすすめしません。 あとUVで図ったとありますが、ライゲーションの反応溶液には１mMぐらいのATPが入ってますよね。ちょっと計算しないとわからないですが、ライゲーション後に測ったならかなり下駄履いてますよね。

(無題) 削除/引用 No.5448-9 - 2016/10/05 (水) 16:53:55 - mon コロニーがでないなら、泳動でバンドがハッキリ見えるくらいの濃度でligationさせるべき。 なお、SfiIは少し厄介な酵素です。PCR産物の末端を切断する場合、 ２カ所の切断部位が内在しないと切断効率が悪い（dimerで機能することが理由らしい）、効果的な切断には長めの足場が必要、至適反応温度が高いためオイル重層・ヒートリッド利用等を行わないと蒸発のため酵素反応液が濃くなり切断効率が落ちる、突出末端が３塩基である（＝self-ligationしない）ためself-ligation反応による切断効率確認ができないためです。 そのため、バンドが見えるくらいの濃度でベクターとインサートを（PEGなしで）37℃で30分ほどligation反応させて泳動してみてください。PEG入りの高速Ligation kitなどを利用している場合は、EtOH沈殿等でPEGを除いて泳動してください。PEG入りだと泳動が乱れます（が、希釈すれば観ないことはない）。

(無題) 削除/引用 No.5448-8 - 2016/10/05 (水) 16:53:32 - SYBR+master おお様 前にうちにいた留学生も同じトラップに引っかかり、O/NでTakaraのligation kitでコロニーが取れなくて四苦八苦してました。そこで、同一のDNAで15分にしたら何も問題なく取れて、そのときどっかのR&D(NEBだとおもう）に聞いた話では、何かいくつも輪がつながったようになるのでTF効率下がります、といわれました。たぶんAFMか何かで実際に見たんだと思います。 添付bufferは、昔はPEGが入っていたと記憶しているんです(NEBのは入っていたような）がですが、今はどのメーカーも入っていませんねぇ。 GibcoのT4DLのは、販売されていたのずいぶん前ですよね？さすがに使ったことないです。PEGの分子量が違うのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5448-7 - 2016/10/05 (水) 16:38:51 - おお ギブコのLigaseはO/Nのプロトコールもなかったっけ。バッファーにPEG入っているので余ったバッファーを他のライゲースで使ったりもするけど。

(無題) 削除/引用 No.5448-6 - 2016/10/05 (水) 16:31:23 - おお ２０ulを１０ulっていうのもなんだかなって気がしますけど。最初から１０ulでやるとか、、、スピードバックでボリューム減らすとか言うのもあるけどね。そもそも濃度が低いから濃くしてもおなじDNA量を流すんだったら変わらないと思うけど、やっぱりWellにのらないことをいってるのかなぁ。。。 バッファーはTRISが入っているかな。。。乾燥後もしかしたらpHが激変するかもね。 まあライゲーションの確認は出来るならすればいいですけど、他にも原因があるかもしれないので（むしろそのような予感がしますので）、全体的にどこが悪いか探ったほうがいいかもしれません。ベクターがPCRプロダクトってコントロールとりにくいな、、、ベクターのみのライゲーションで若干バックグランドが出るくらいのDNA量使ったぐらいがいいとは思いますが。というのもPCRプロダクトはメチレーションされてないので、大腸菌に分解されやすいですから（菌株によって分解しやすさに差がありますけどね）。

(無題) 削除/引用 No.5448-5 - 2016/10/05 (水) 16:24:02 - SYBR+master Ligation kit(たぶんPEGを含んでるはずです)での反応時間は、キット指定の時間を超えないように注意してください。 PEGを含むT4 DNA ligaseの反応は、長時間反応すると形質転換効率が低下することが報告されています。(NEBの英語版のHPのBlunt/TA Ligase Master MixにおけるFAQで確認してください） 前に聞いた話ですが、PEG含有で長時間反応すると、どうしてそうなるかは解っていないようですがplasmidが数珠つなぎ？みたいな高分子になってしまい、形質転換効率が下がるそうです。なので、その分子はAGEでは確認できなくなります。

(無題) 削除/引用 No.5448-4 - 2016/10/05 (水) 16:17:17 - AP あと、なんどもこのサイトで指摘してきたように、ライゲーション産物を泳動してみてもあまり有用な情報は得られない。 形質転換の時に1 pgでも有効なライゲーション産物があれば数百コロニーは生えるはずだけど、その量のDNAは泳動しても見えないものね。実際の実験では、数個から数十個程度しか生えないこともあるんだから、なおさら見えないよね。それでも、実験の目的は達成しているわけだ。 先の投稿のリンク先にあるように、制限酵素処理したPCR産物だけでライゲーションして重合が起こっているかどうかで、末端の消化効率の評価ができる。このチェックは有用。 全くと言っていいほど形質転換体が出ない場合、切り出し操作の時のUVでDNAにピリミジンダイマーが生じている可能性がたかい、ということは繰り返し指摘されていると思うけど、その点はどうだろうか？

(無題) 削除/引用 No.5448-3 - 2016/10/05 (水) 15:54:22 - AP なんで基本手技であるエタノール沈殿をしないで凍結乾燥なのか、まずそこツッコミどころ。

(無題) 削除/引用 No.5448-2 - 2016/10/05 (水) 15:47:00 - 123 ligation直前にDNAのバンドがあることを確認できたら消えることはないでしょう。 Ligation 出来たかどうかのとこは掘り下げないで、 5436クローニングについて http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=5436 のスレッドにあるようにサブクローニングした方がいいんじゃないんすか。

ライゲーション後の確認 削除/引用 No.5448-1 - 2016/10/05 (水) 14:44:08 - 亀子 現在遺伝子組み換えの実験を行っているのですが、なかなかうまくいっておらず、形質転換後にコロニーが得られません。そこで、ライゲーション後にうまくライゲーションが起こっているのか確認できないかと、今検討しているところです。 組み換えは、ベクター(約4800bp)とインサート(約700bp)をそれぞれPCRで増幅させた後、2種類の制限酵素(Sfi I、Not I)でそれぞれ処理(12hずつ)を行っています。そして、それぞれの断片を、インサートがベクターの3倍量になるように加え、Ligation　Kitを用いてライゲーション反応(16℃、16h)を行っています。その後、ライゲーション産物を大腸菌のCompetent Cellに形質転換を行っているのですが、コロニーができません。 そこで、ライゲーションができているか確認するために、ライゲーション後のサンプルを電気泳動で流し、ライゲーション前後でバンドの変化があるのか確認を行うことにしました。しかし、ライゲーション後のサンプルはそのままでは濃度が低くバンドが見えないため、凍結乾燥を用いて濃縮することにしました。 凍結乾燥では、ライゲーション後のサンプル(20 µl)をPCR用のチューブに入れ、そのまま液体窒素で凍らせ凍結乾燥を行いました。凍結乾燥後、RNase Free water で再溶解(10 µl)しました。そして、凍結乾燥後のサンプルを電気泳動で確認したのですが、バンドが全く確認されませんでした。UVスペクトルでは、260nmにピークが見られたため、DNAは存在すると考えられるのですが、電気泳動のバンドはなくなってしまいました。この原因が現在わかっていないため、意見を頂きたいです。

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