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逆転写で使ったのと同じプライマーでPCRで、増えない トピック削除
No.5590-TOPIC - 2016/12/01 (木) 02:04:30 - RT
不思議な現象に出くわして戸惑っているのですが、ある遺伝子から13塩基ほど下流のプライマー(その遺伝子の3'末端と、3塩基オーバーラップ)で逆転写を行い、その遺伝子の全長(下流の配列を含まない)のプライマーセットでPCRを行ったらバンドが得られたものの、逆転写で使った「13塩基+3塩基」のプライマーでPCRを行ったら、理論上は全長+13塩基のバンドが得られるはずだと思うのですが、何も増えませんでした(Forwardは当然同じプライマーです)。

あまりにも謎すぎてなぜそうなるのか不明なのですが、何か見落としている落とし穴などがありましたらご教示いただけるとありがたく思います。
 
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31件 ( 1 〜 20 )  前 |  1/ 1. 2. /2


HALtyKSeqfpJ 削除/引用
No.5590-34 - 2017/07/31 (月) 01:21:36 - JimmiXzSqc
QIxBBQ http://www.FyLitCl7Pf7ojQdDUOLQOuaxTXbj5iNG.com

(無題) 削除/引用
No.5590-33 - 2017/03/30 (木) 20:50:15 - 青年
先入観による誤読とまで言い切っておいて、「見解は理解したと思います。それでいいと思います。」?

まあ白黒付いて良かった。

(無題) 削除/引用
No.5590-32 - 2017/03/30 (木) 18:39:26 - AP
さっきwikipedia見たら、
closed reading frames (CRF)
という記述があってたまげた。

(無題) 削除/引用
No.5590-31 - 2017/03/30 (木) 18:37:00 - AP
まあ、用語作られたときは素朴な概念で厳密な定義なしに直感的な名前がつけられたけれど、新しい知見が概念が増えてきて、また考え方の厳密さも要求されるようになって、用語の意味、概念が揺らいだり変化してきたりという例は数えきれません。キャラ設定が定まっていないうちに、物語を初めてしまって途中でつじつまが合わせに困るみたいな。

パッと思いつくのでは、operon、coding region、coding strand、retrovirusなどなど、


出自にこだわるより今まさに通用している概念を共有するのがいいですね。

(無題) 削除/引用
No.5590-30 - 2017/03/30 (木) 17:59:22 - AP
etymologyに関する見解は理解したと思います。
それでいいと思います。

>これはORFであるがこれはORFでないと峻別できるものではないのでしょう。実際の使われ方もそのようであると実感していますがどうでしょうか。

ORFは恣意的に決めるものではなくて配列で自動的に決まっているものではないでしょうか。極端に短いものは省くとしても(何コドン以上のORFをサーチした、みたいに条件をつけるのは普通ですから)複数の読み取り枠はとれるわけですよね。あるORFがほかの別のORFより短かったら(より早く終止コドンでcloseされたら)その読み枠は"open" reading frameとは呼ばない、なんてことないですよね。

終止コドンによってcloseされているのでopenではないというなら、真のCDSだって終止コドンに最後にはブロックされてるんだから、またUTRに頻繁に終止コドンがあらわれるのはごく普通ですから、なにをもってopenだclosedだって区別すんでしょうね。感覚的なもの、相対的なものでしょう。引用文も対比できるORFがあるからほかのはclosedだってんでしょう。で、そのclosedであるほ読み枠をなんて言い表すかといったら、ORFて記述すんじゃないですかね。
ORFのopenが引用文にあるようなopenの意味から来てるとしても、ORFとひとつの成語になったときに、もととはちょっとニュアンスの違う、後戻りできない概念になったんじゃないかという気がします。

(無題) 削除/引用
No.5590-27 - 2017/03/30 (木) 17:14:22 - 774R
ORFについて語源や定義は諸説あるようですが、実務的な意味で使うORFはこのような例があります。
遺伝子解析ソフトでは、ある塩基配列に対して「Find ORFs」というコマンドを実行すると、3つの読み枠と相補鎖で計6つの読み枠に対してさまざまなORFを返してきます。もちろんその中の一つに本来のタンパク質をコードするCDSも含まれるといった具合です。

つまり、ORFはストップコドンを含まないATGから始まって連続するある程度の長さの読み枠という使い方がされているということです。

(無題) 削除/引用
No.5590-26 - 2017/03/30 (木) 17:11:45 - 中年
もちろんopenがどのくらいの長さ以上を指すかにつて曖昧さがあるのはわかります。でも、「たった2アミノ酸残基から成るペプチドをコードする最小の遺伝子を発見!」みたいな極端な例を除けば、ある程度の長さを持ったopenなreading frameはcoding regionの候補である可能性が高いだろうというoperationalな使い方をするための言葉であって、これはORFであるがこれはORFでないと峻別できるものではないのでしょう。実際の使われ方もそのようであると実感していますがどうでしょうか。

ともかく、引用した箇所に見られる複数のopenがそれぞれ違った意味で使用されていると考えるのには無理があると思います。

(無題) 削除/引用
No.5590-25 - 2017/03/30 (木) 16:56:07 - AP
もし引用された文でいっているopenがopen reading frameのopenと同じだとしたら
>本題から逸れることですみません。ORFがタンパク質をコードしているという含意がないということはそのとおりだと思うのですが、

というのは間違いということになりませんか。頻繁な終止コドンに阻まれるとはいえ他の読み枠でもコドンの連続はとれるわけで、そういうのはORFとはいわないんですか?

語源はどうでも、意味しているところが同じならどっちでもいいやと思ってたんですけど、おのおの指し示しているものがちがっているのかしら?

(無題) 削除/引用
No.5590-24 - 2017/03/30 (木) 16:41:21 - 中年
引用した箇所の次のパラグラフにopen vs. closedと捉えている文章がありました。

When the sequence of a DNA region of unknown function is obtained, each possible reading frame can be analysed to determine whether it is open or closed. Usually no more than one of the three possible reading frames is open in any single stretch of DNA. FIGURE 1-41 shows an example of a sequence that can be read in only one reading frame because the alternative reading frames are closed by frequent termination codons.

(無題) 削除/引用
No.5590-23 - 2017/03/30 (木) 16:36:01 - 中年
うーん、「この文は」というのはどこからどこまでを指していますか?

closedとblockedは実際にはハイライトされているので、openと対比しているとしか見えないんですけどね。リンク先をご覧になってみてください。

https://books.google.co.jp/books?id=pNdLDgAAQBAJ&pg=PA29&lpg=PA29&dq=open+reading+frame+lewin&source=bl&ots=Qxu0874jjX&sig=CY6rNAJItS3TM3_LI6fLZRB_Ub4&hl=ja&sa=X&ved=0ahUKEwj3hJqy2f3SAhUpjlQKHbXWC58Q6AEIMjAD#v=onepage&q=open%20reading%20frame%20lewin&f=false

最後のパラグラフから、Benは少なくとも「reading frameがstpo codonを含まない(stop codonに当たると途切れる)のは自明ですから」とは思っていないことになりますよね。

ところで、openが「未決の」という意味であるということについて典拠を挙げていただくことは可能ですか?

(無題) 削除/引用
No.5590-22 - 2017/03/30 (木) 16:21:15 - AP
>openがclosedもしくはblockedと対比される意味で使われていることがわかると思います。

open reading frameのopenとこの文脈のclonsedが意味的に対比されていると必ずしも言えんと思うけどな。open, closedはたしかに対義だが(真の対義語はopenとcloseですから著者が対を意識したとも思えないが)意味範疇は日本語の開いた閉じたとは100%オーバーラップするものじゃないから。open

この文は「実際に翻訳されるreading frame」は開始コドンに始まり終止コドンに終わる、その間に終止コドンがない(あたりまえだ、あったらそこが翻訳の終止だ)、終止コドンが頻繁にあらわれないものである、ってことで、そうでないものはclosedだってんでしょ。いやいや、open reading frameは開始コドンから近くたって、開始コドンなくたって(読んだ配列範囲に見つかってなくたって)、頻繁に終止コドンにぶつかったって、tripletが複数連続していたらORFですよ。それが実際に翻訳されるかどうかは無関係。「実際に翻訳されるreading frame」がORFを意味しているのではないのだから、closed、blockedがORFのopenに対比されているというのは意味から言っておかしい。

著者はそう書いていないしそう理解しているわけでもないだろうけど、初学者にとっては「実際に翻訳されるreading frameをORFという」という誤解や、open reading frameに対比されるreading frameがclosedという状態、あるいはclosed reading frameという概念がある、という誤解を与えかねない。

(無題) 削除/引用
No.5590-21 - 2017/03/30 (木) 15:08:05 - 中年
異論サイドです。Ben LewinのGENES XIIから引用します。openがclosedもしくはblockedと対比される意味で使われていることがわかると思います。

If the genetic code is read in nonoverlapping triplets, there are three possible ways of translating any nucleotide sequence into polypeptide, depending on the starting point. These are called reading frames. For the sequence

ACGACGACGACGACGACG

the three possible reading frames are

ACG ACG ACG ACG ACG ACG
CGA CGA CGA CGA CGA CGA
GAC GAC GAC GAC GAC GAC

A reading frame that consists exclusively of triplets encoding amino acids is called an open reading frame (ORF). A sequence that is translated into polypeptide has a reading frame that begins with a special initiation codon (AUG) and then extends through a series of triplets encoding amino acids until it ends at one of three termination codons (UAA, UAG, or UGA).
A reading frame that cannot be read into polypeptide because termination codons occur frequently is said to be closed, or blocked. If a sequence is closed in all three reading frames, it cannot have the function of encoding polypeptide.

(無題) 削除/引用
No.5590-20 - 2016/12/03 (土) 07:09:55 - 中年
Protocol Onlineにも次のような記載がありました。筆者が私と同じ誤解をしている可能性はありますが。

The "Open" part refers to the lack of a stop codon within the reading frame.

http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/3701.html

(無題) 削除/引用
No.5590-19 - 2016/12/03 (土) 06:56:48 - 中年
Wikipediaのreading frameの項を読むと、少なくともその執筆者はreading frameがstpo codonを含まないのは自明とは捉えていないようですが。

In molecular biology, a reading frame is a way of dividing the sequence of nucleotides in a nucleic acid (DNA or RNA) molecule into a set of consecutive, non-overlapping triplets. Where these triplets equate to amino acids or stop signals during translation, they are called codons.

https://en.wikipedia.org/wiki/Reading_frame

(無題) 削除/引用
No.5590-18 - 2016/12/02 (金) 23:04:26 - AP
>読み枠(reading frame)が通っていない、通っているという用法も普通に使われているように思います。

あったとしても日本語に限ったjargonじゃないですか? 英語でそういう表現ありますか?

(無題) 削除/引用
No.5590-17 - 2016/12/02 (金) 22:56:44 - AP
先入観による誤読です。
まずreading frameという言葉ありき、それがopenであるということですから。

(無題) 削除/引用
No.5590-15 - 2016/12/02 (金) 22:20:09 - 中年
wikipediaの説明もreading frameが通ってるという風に読めます。

読み枠(reading frame)が通っていない、通っているという用法も普通に使われているように思います。

(無題) 削除/引用
No.5590-14 - 2016/12/02 (金) 22:10:51 - AP
open questionとか、予定はopenだとかいうのと同様の用法だと思います。reading frameがstpo codonを含まない(stop codonに当たると途切れる)のは自明ですから、わざわざそれを示す言葉を添える理由はないわけで。wikipedeaででもご確認を。

(無題) 削除/引用
No.5590-13 - 2016/12/02 (金) 20:01:14 - 中年
> ORFすなわちopen reading frameのopenとは「未決の」というような意味であり、実際に翻訳されるかどうかは未決定ではあるけれど、その配列から取りうる読み枠という、といったものを指します。

本題から逸れることですみません。ORFがタンパク質をコードしているという含意がないということはそのとおりだと思うのですが、openは「終止コドンが入って止められていない(開いている)」という意味だと思っていました。

(無題) 削除/引用
No.5590-12 - 2016/12/02 (金) 01:28:20 - RT
APさんありがとうございます。
クソみたいに下手な説明と、用語の適当さはお恥ずかしい限りです。もちろん誤用していたのには間違いないんですが、一応言い訳しておくと、本当は対象はmRNAではなく、別のRNA(まぁぼやかす意味もないんですが、本質的には同じことなので、より分かりやすいつもりでmRNA(遺伝子)の下流から、って感じで書いた結果、より分かりづらくなってしまった次第です)なので、そういった理由で説明がぼやっとしてしまった感じです。
まぁでもそもそも実際mRNAを使っていたとしても、多分『ORF』と書いてしまっていたと思うので、理解がヤバイことに違いはないんですけどね。

とりあえず、この現象については、そんなに不思議なことでもないという反応をいただけてよかったです。アドバイスどうもありがとうございました…!

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