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(無題) 削除/引用 No.5590-13 - 2016/12/02 (金) 20:01:14 - 中年 > ORFすなわちopen reading frameのopenとは「未決の」というような意味であり、実際に翻訳されるかどうかは未決定ではあるけれど、その配列から取りうる読み枠という、といったものを指します。 本題から逸れることですみません。ORFがタンパク質をコードしているという含意がないということはそのとおりだと思うのですが、openは「終止コドンが入って止められていない（開いている）」という意味だと思っていました。

(無題) 削除/引用 No.5590-12 - 2016/12/02 (金) 01:28:20 - RT APさんありがとうございます。 クソみたいに下手な説明と、用語の適当さはお恥ずかしい限りです。もちろん誤用していたのには間違いないんですが、一応言い訳しておくと、本当は対象はmRNAではなく、別のRNA（まぁぼやかす意味もないんですが、本質的には同じことなので、より分かりやすいつもりでmRNA（遺伝子）の下流から、って感じで書いた結果、より分かりづらくなってしまった次第です）なので、そういった理由で説明がぼやっとしてしまった感じです。 まぁでもそもそも実際mRNAを使っていたとしても、多分『ORF』と書いてしまっていたと思うので、理解がヤバイことに違いはないんですけどね。 とりあえず、この現象については、そんなに不思議なことでもないという反応をいただけてよかったです。アドバイスどうもありがとうございました…！

(無題) 削除/引用 No.5590-11 - 2016/12/01 (木) 16:54:57 - AP で、質問への回答は、たぶんじっくりと条件検討すれば全く増えないということにはならないんじゃないかと。たとえば、アニール温度をぐっと低くしてみるとか。 RTとPCRでアニール温度、反応温度も全然違うはずですし、 ありがちなことで、そんなに不可思議なことかなあと。

(無題) 削除/引用 No.5590-10 - 2016/12/01 (木) 15:49:07 - AP あるいは「翻訳配列（翻訳領域）、translated sequence (region)」かな。

(無題) 削除/引用 No.5590-9 - 2016/12/01 (木) 15:43:17 - AP >ある遺伝子から13塩基ほど下流のプライマー（その遺伝子の3'末端と、3塩基オーバーラップ）で逆転写を行い、その遺伝子の全長（下流の配列を含まない）の 意味するところは「遺伝子」でも「ORF」でもなくてCDS (coding sequence)あるいはreading frameでしょう。そういう実験をしているんだからあなたも素人じゃないはずで、用語を正確に理解し使用していないのはヤバいです。 なお、CDSの意味でORFを使っている人もいますが、間違いです。 ORFすなわちopen reading frameのopenとは「未決の」というような意味であり、実際に翻訳されるかどうかは未決定ではあるけれど、その配列から取りうる読み枠という、といったものを指します。

(無題) 削除/引用 No.5590-8 - 2016/12/01 (木) 06:22:25 - 名無しのポスドク あ、なるほど。「3塩基オーバーラップ」の言葉から勘違いしてました。 >RT(-)で、『全長プライマーセット』で増えてこない であれば、やっぱりPCRの条件が微妙にマッチしていないだけじゃないですかね。annealing temp. をかなり下げた、緩い条件でPCRすれば増えてきたりするんじゃないですかね？

(無題) 削除/引用 No.5590-7 - 2016/12/01 (木) 05:55:31 - RT 度々アドバイスありがとうございます。 名無しのポスドクさんのご指摘ですが、ちょっと説明と言葉の使い方が悪かったんですが、13塩基は直下の3'UTRで、「遺伝子の全長」というのはORFを増やすプライマーセットを使って増やしたもの、という話でした。従って、13+3塩基のプライマーも、16塩基全てがmRNAと相補的（のはず）です。 また、RT(-)で、『全長プライマーセット』で増えてこないのも確認済です。うーん、おおさんのご説明からそういうこともあり得る、という気もしますが、やっぱりちょっと不思議な気もしますね…。

(無題) 削除/引用 No.5590-6 - 2016/12/01 (木) 03:59:53 - 名無しのポスドク 13塩基＋3塩基のプライマー。。。プライマーとしては16塩基は無くはないけれど、オーバーラップが3塩基というのはかなり短い気が私はします。そういうプロトコールがあるのでしょうか？　自分が昔使ったことのあるランダムプライマーは8塩基でしたな、そういえば。 >逆転写の方がPCRよりも走りやすいんでしょうか…？個人的には逆の印象ですが、根拠はなく単なる印象です 逆転写がそのプライマーでうまくいっているならば、相補性のある部分が3塩基から16塩基に増えているわけだから、この話で言えば確かにPCRの方が（逆転写に比べて）走りやすいはずな気はします。 めったに無い話なので、念のため確認ですが、その遺伝子がエキソン一個だけのかなり短いもので、実は逆転写はうまくいってない（だから逆転写に使ったプライマーでは増えない）けれど、遺伝子の内側にデザインされたプライマーでのPCRでは、微量にコンタミしているgenomic DNAを元に増幅された、ということは無いですか？さすがにそんなことはないか。。。、

(無題) 削除/引用 No.5590-5 - 2016/12/01 (木) 03:33:08 - おお 前述してますが、条件の工夫次第でかかる可能性はあると思います。

(無題) 削除/引用 No.5590-4 - 2016/12/01 (木) 03:31:41 - おお まあ酵素も違いますし、RTは高温でできるものも最近ありますけどランダムヘキサマーでアニーリングさせることもできますので。高温でできるRTでランダムヘキサマーを使うときはアニーリングを低温で確実にしておいてから高温にシフトさせたりもするようですし。 あと比べたことないですがプライマーの至適濃度とかも影響するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5590-3 - 2016/12/01 (木) 03:24:36 - RT おおさんありがとうございます。 あれ、16塩基ってそれほど短すぎる印象でもなかったですが、まぁ短いといえば短いですね（使っている会社の、注文できる最小塩基オリゴが16merからのようですし）。 しかし短くても、少なくともそのプライマーでcDNAは合成されているはずですし、cDNAが合成されているならPCRも走ってくれても良さそうな気もしますが（逆転写の方がPCRよりも走りやすいんでしょうか…？個人的には逆の印象ですが、根拠はなく単なる印象です）、プライマーによってはそうも行かないものなのかもしれないですね。 余裕があったら条件検討してみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.5590-2 - 2016/12/01 (木) 02:45:40 - おお 「13塩基＋3塩基」ってちょっと短すぎないですか。 プライマーって配列によって増えやすかったり増えにくかったりしますし、両者を考慮するとあまり驚きませんが、、、 もしかしたらアニーリングの温度を下げてやるとバンドが出るかもしれません。

逆転写で使ったのと同じプライマーでPCRで、増えない 削除/引用 No.5590-1 - 2016/12/01 (木) 02:04:30 - RT 不思議な現象に出くわして戸惑っているのですが、ある遺伝子から13塩基ほど下流のプライマー（その遺伝子の3'末端と、3塩基オーバーラップ）で逆転写を行い、その遺伝子の全長（下流の配列を含まない）のプライマーセットでPCRを行ったらバンドが得られたものの、逆転写で使った「13塩基＋3塩基」のプライマーでPCRを行ったら、理論上は全長＋13塩基のバンドが得られるはずだと思うのですが、何も増えませんでした（Forwardは当然同じプライマーです）。 あまりにも謎すぎてなぜそうなるのか不明なのですが、何か見落としている落とし穴などがありましたらご教示いただけるとありがたく思います。

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