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ウエスタンブロットで転写後の気泡について トピック削除
No.5845-TOPIC - 2017/03/16 (木) 23:23:57 - ミミ
転写後のメンブレンをポンソーで染めると気泡でトランスファーがうまく行ってないことが時々あるのですが、どのようにしたら安定して実験することができるでしょうか?

転写はウェットで行なっています。
ろ紙、ゲル、メンブレンを重ねる際はバッファーをかけて気泡をできるだけ除くように心がけていますがどうしても気泡が入ってしまいます。
全部重ねた後はローラーで軽く空気を除くように押し出しもしています。
 
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(無題) 削除/引用
No.5845-21 - 2017/03/22 (水) 09:50:52 - AP
プロット中の短い時間よりはるかに長い時間、実験に使う水や濃縮バッファなどは空気にさらされているわけです。「純水」は通常degasはしていないのでpHが酸性に傾いているはずです。空気中の二酸化炭素が自然に溶けこんできているからです。塩基性のバッファなんかだと二酸化炭素がさらに溶けやすいです。そのへん気になりませんかね

(無題) 削除/引用
No.5845-20 - 2017/03/22 (水) 09:34:29 - AP
電気抵抗が温度によって変わるので、ブロット槽のなかで温度ムラができるとブロットのムラにつながります。通電すると局所的にかなり温度が高温になるのでタンパク質の熱変性でアグリゲーションを起こしたり(ブロット中はSDS化は解けてくるので)抗原性の低下が起こる可能性もあります。で、もちろん、ゲル面付近で高温になればメンブレンとの界面に気泡ができやすなります。

対流だけでは温度ムラや高熱の解消が不十分になりがちなのでスターラーやポンプでバッファーを攪拌する意義はあります。

冷却をしなければバッファー自体の温度はもっと上がるので、気泡は出やすくなると思います。問題はブロット中に気体が溶け込むことではありません(そんなの問題になるほどではないでしょう)。バッファーに最初から溶けている気体を減らすか(脱気)、ブロット中に遊離させないか(温度を下げる)じゃないですか、

ちょっと視点がずれたところで固まって理屈が通らなくなっているような気が、

(無題) 削除/引用
No.5845-19 - 2017/03/22 (水) 09:31:54 - taka
> 転写槽にスターラーを入れていますが
スターラーで撹拌しながら転写しているのですか?
私の所属したラボではしたことがないです。普通に転写できますよ。
温度を均一に、という意味ではタンク全体を十分に冷やしながらやれば(うちでは氷水です)実験上問題ない程度は保たれています。

(無題) 削除/引用
No.5845-18 - 2017/03/22 (水) 01:15:32 - ミミ
皆さんありがとうございます。

気体は低温の方が溶けやすいので確かに冷却しない方がいいかもしれませんね。
転写は低温室で行なっていますが(現ラボ)、これは温度上昇を抑える目的でやっています。
以前いたラボでは室温で転写していましたが問題なかったです。ですのでバッファーは特に冷やしたりする必要もないのかなというのが正直な考えです。

あともう一点気になったことがあるのですが、転写槽にスターラーを入れていますが、これはタンク内の温度が均一にすることが目的と考えてよろしいでしょうか?この時もスターラーのスピードによって泡が出ますが、さすがにこの泡がメンブレンとゲルの間に入り込むとは思えませんが。

スターラーで撹拌しなくても転写は問題なくできるのか知りたいです。
ご存知の方いましたら教えてください。

(無題) 削除/引用
No.5845-17 - 2017/03/21 (火) 12:15:55 - 2
気のせいかもしれないですが、メタノールとbufferを混ぜた時に、転倒混和すると泡がたくさんでてなかなか消えにくい気がするので、今はスターラーで混和してます。PVDF膜の上に泡がたくさん付くようなときもあるので、ゲルと重ねる直前にbuffer中で膜をピンセットでつまんで振って泡を出来るだけ除くようにしています。

(無題) 削除/引用
No.5845-16 - 2017/03/21 (火) 09:51:07 - AP
あと、冷蔵保存したアガロースゲルとか寒天培地で、泳動や培養で温度が上がったときに気泡が出来た経験はないですか? キャスト直前、あるいは冷めすぎた状態で激しく混和したりすると空気が溶けこみ、温度が上がったときに遊離、膨張してそうなります。

(無題) 削除/引用
No.5845-15 - 2017/03/21 (火) 09:47:54 - TS
大きさはわかりましたが、たくさん出るんでしょうか。
1個くらい入っちゃうのは、それなりに仕方ないこともあると思うんだけども。
自分のターゲットの上になければいいかなぁと。

(無題) 削除/引用
No.5845-14 - 2017/03/21 (火) 09:45:06 - AP
そりや、ガスが溶存していても、上昇した温度でもその温度における飽和濃度以下なら気泡の原因にはなにりくいでしょう。
逆に、温度上昇がわずかでも、ガス濃度がその温度における飽和を超えれば気泡は生じます。

だから単純に温度だけ、あるいはガス濃度だけがパラメータであるわけじゃないです。しかし、ガス濃度をゼロに近づけておけば多少過熱したとしても影響が少ないというのは確か。

ゲルろ過とか液クロでは、冷蔵保存している試薬やゲルは使用温度に平衡化し、減圧や超音波で脱気してしてからやるもんですよね。
使用中に温まったりしてゲルベッドやラインに気泡が生じては事ですから。

(無題) 削除/引用
No.5845-13 - 2017/03/21 (火) 00:10:54 - おお
メタノールを混ぜた直後に溶液中に小さい気泡がいっぱい生じます。なのでバッファー調製後しばらくおいておいたほうが良いです。それでも気泡が容器の側面についていることもあるので、調製10分後ぐらいに一度転倒混和したりするとなおいいかと思います。

気体は冷やすと溶液に吸収されやすいので調製後、冷蔵庫に入れるとかOn iceで置いておくとか言うのも一つの手です。

(無題) 削除/引用
No.5845-12 - 2017/03/20 (月) 20:35:14 - ミミ
1ミリ前後の大きさです。
極端に大きなものではないです。

(無題) 削除/引用
No.5845-11 - 2017/03/20 (月) 20:21:38 - 私の名はミミ
気泡ってどのくらいのサイズのものの話をされていますか?

(無題) 削除/引用
No.5845-10 - 2017/03/20 (月) 18:58:23 - ミミ
お返事遅くなりすみません。

確かに、10xbufferとメタノールを混ぜてすぐ使ってるように思います。
ゲルを流してる間に調製しておけば良さそうですね。
私の経験ではバッファー自体を事前に冷やしても、冷やしてなくてもどっちでも良い印象ですが、転写槽に冷却材を入れる理由は温度が上がるのをできるだけ下げたいからですよね?
温度が上がることは気泡が入る可能性を上げる原因になりうるのでしょうか?

経験では温度が上がるのはゲル濃度にも依存しますのでなんとも言えないと思いますが、湯気が出るほど温度上がってても転写がダメだった経験はありません。

今回の問題に限って言えば、バッファーの温度が非常に高くなってるとは思いませんでした。
ぬるくはなっていましたが。

(無題) 削除/引用
No.5845-9 - 2017/03/18 (土) 15:37:05 - 2
transfer bufferをworking slutionとして調製後、1時間くらいおいておくとけっこう泡は減ります。10xbufferやメタノールを混ぜて直ぐ使うと泡が多い気がします。経験からローラーはあまり有効ではない気がしていて使ってません。カセットの組み立てをbuffer中で行う事は重要ですが、それでも泡の入る危険はありますので注意しています。そうした点をクリアしてても泡によるトラブルが多発するなら機器あるいはbuffer組成になんらかの問題があって転写中に許容限度をこえる発熱が発生しているのかもしれません。たとえば氷の溶け方が最近ハンパなく早いとか、終了後、転写bufferが変に暖かすぎるとか(湯気が出るとか)ないですか?

(無題) 削除/引用
No.5845-8 - 2017/03/17 (金) 22:42:27 - AP
直前にバッファを作っているということですが、そこでガシガシ転倒混和とかステアリングとかしてるわけですよね。それで空気がかなり溶け込みま。そもそも加える水にだって空気が溶け込んでるはずです。
ゲル濾過だとか液クロだとかしてると如実にわかります。

(無題) 削除/引用
No.5845-7 - 2017/03/17 (金) 22:13:15 - AP
そうですよね。メンブレンに気泡の跡が出るってことはゲルとメンブレンの間に気泡が入るってことでしょう?
その外側にあるスポンジってのはなあ

(無題) 削除/引用
No.5845-6 - 2017/03/17 (金) 21:57:38 - ミミ
今まで数年ウエスタンをやってきましたが、泡が入るようなことはほぼなかったため非常にガックリしております。
一番良さそうなのはバッファーでスポンジ、ろ紙などカセット自体を浸してしまう方法ですね。
後バッファーは使うその日に作って冷やしておく方が良さそうですね。低温室で転写しているのですがバッファーはその都度直前に作っているため緩い状態です。これが気泡の原因とは考えていなかったのですが一度試してみます。
後、スポンジ内の気泡は転写に影響するのでしょうか?
てっきり、ろ紙、ゲル、メンブランの間で気泡が入らなければいいと思っていましたが、実はスポンジ内の空気も抜くとなると、完全にスポンジが浸るだけのバッファーが毎回必要になりそうですね。

(無題) 削除/引用
No.5845-5 - 2017/03/17 (金) 09:54:15 - AP
うちでは室温保存なんですが、ふだんトランスファーバッファーは冷蔵保存ですか?
冷蔵保存したものは室温に持ってくるだけでかなり気泡がでます。
逆の意見もあるようだけど、

(無題) 削除/引用
No.5845-4 - 2017/03/17 (金) 09:28:05 - AP
熱でバッファーとけているガスが気化してるんじゃないでしょうか。
トランスファー中の冷却は十分でしょうか。
事前にトランスファーバッファーを超音波処理するとか加熱するとかしてdegasしておくといいかもしれない(減圧でもいいけどSDSなんかが入った系では泡立ってしまう)。

(無題) 削除/引用
No.5845-3 - 2017/03/17 (金) 09:15:42 - TS
わたしは完全にバッファー内で組み上げます。

タッパーのようなものにたっぷりとバッファーを入れておいて(これは、前回転写に使ったバッファーの再利用です)、そのなかにスポンジやろ紙を沈めて十分に吸水させた後に、カセットを敷いて、それぞれを水中で積み上げて、ローラーやって、カセットを閉じます。

たまには気泡が残るけど、運悪く自分のタンパク質のところじゃなければOKだし。

(無題) 削除/引用
No.5845-2 - 2017/03/17 (金) 07:22:36 - しろ
Gelを電気泳動している間にメンブレンを準備すると思いますが、トランスファーに使用するスポンジ、フィルター、メンブレンをトランスファーバッファーに浸して冷蔵庫に冷やしておきます。トランスファーバッファー自体は冷蔵にあるでしょうから一緒に。泳動が終わってゲルやメンブレンを重ねるときに冷えた状態のものでやると気泡が入りづらくなったと感じます。当方も以前気をつけていてもフィルムにしたときにバンドが丸く抜けててがっかりという経験があります。長いステップでやる実験なのでショックですよね。別の研究室でこの工夫をしていたのをマネしたところ、ほぼ気泡があるフィルムを出すことはなくなりました。同じプロトコールでしたらすみません。

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