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(無題) 削除/引用 No.6660-25 - 2018/02/09 (金) 12:31:50 - toto EGFPの蛍光基のpK値は6近辺なので、1%酢酸（確か、pH3くらい）まで落とす必要は無いでしょう。pH5.7あたりから急速に光らなるから、そのあたりから振ってみてファライジンは結合するけどＧＦＰは光らない条件がみつかるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6660-24 - 2018/02/09 (金) 09:59:31 - 学生 フォトブリーチはサンプル数が多くなるので今回は見送りました。すみません。。 どうなんでしょうかね。どのくらいの強さで24ウェル全体がブリーチされるんでしょうか。。

(無題) 削除/引用 No.6660-23 - 2018/02/09 (金) 08:32:27 - おお How about photobleaching.

(無題) 削除/引用 No.6660-22 - 2018/02/09 (金) 07:36:06 - 学生 monさん、 うえええええ。そうでした。その可能性はありますね。 めっちゃ光ってますし、、、。 ファロイジンレッドで染めないもので、赤のチャネルでどれだけ染まってるか見ることにします。 ありがとうございます。 >[Re:21] monさんは書きました : > GFPが明るすぎるようだと、蛍光のクロストーク（赤色への漏れ込み）にも気を付けて解析してください。

(無題) 削除/引用 No.6660-21 - 2018/02/09 (金) 07:16:19 - mon GFPが明るすぎるようだと、蛍光のクロストーク（赤色への漏れ込み）にも気を付けて解析してください。

(無題) 削除/引用 No.6660-20 - 2018/02/09 (金) 03:31:29 - 学生 アップデートします！ 1.　100% methanol, 10 min固定、（GFPは消えるが、ファロイジンは染まらないはず） 2.　4% PFA, 20 min固定、（GFPは強いままだが、ファロイジンは染まるはず） 3.　4% PFA, 20 min固定後、100% methanol, 10 min 4.　4% PFA, 20 min固定後、100% methanol, 2 min 5.　4% PFA + 1% glacial acetic acid, 20 min固定、 1ではGFP蛍光は消失しますが、ファロイジンでは染らず。 2ではGFPバンバン光り、ファロイジンもきっと染まっているはず。 3、4ではGFPは消失しましたが、ファロイジンでは染まりませんでした。。。。 5でもGFPはがっつり消失しましたが、これでもファロイジンでは染まりませんでした。 残念ですが、赤色のファロイジンが届くのを待つほかないみたいですね。。 1％氷酢酸のファロイジンが結合しなくなるメカニズムは、メタノールのそれと同じでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6660-19 - 2018/02/08 (木) 13:46:42 - 学生 AP様、774R様、 タームノロジーは注意して使うべきですね。ありがとうございます。 さて、PoP様ありがとうございます。早速みてみました。 4%PFA + acetic acidでGFPが消えるようですね。数%程度でしょうか？かかれてありませんでした。 まずは、 100% methanol, 10 min固定、（GFPは消えるが、ファロイジンは染まらないはず） 4% PFA, 20 min固定、（GFPは強いままだが、ファロイジンは染まるはず） 4% PFA, 20 min固定後、100% methanol, 10 sec 4% PFA, 20 min固定後、100% methanol, 2 min 4% PFA + 1% glacial acetic acid, 20 min固定、 4% PFA + 10% glacial acetic acid, 20 min固定、 この6通りでやってみます。ありがとうございます＞＜。

(無題) 削除/引用 No.6660-18 - 2018/02/08 (木) 13:38:45 - 774R 単に紛らわしいだけですから使い続けるのは問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.6660-17 - 2018/02/08 (木) 13:21:14 - AP 蛍光のクエンチだって日常語の意味範囲で通じるし、むしろ専門用語のほうが日常語を転用しているのだから、本末転倒でしょう。用例をみてもそれほど珍しい使い方でもないし。 あなた以外の大抵の人には誤解も招かないし、違和感もないと思う。 >誤解を避けるために使わないほうが無難。 いらぬお世話にございます。 over

(無題) 削除/引用 No.6660-16 - 2018/02/08 (木) 13:15:46 - 774R 「クエンチ」単独なら広義の意味で使われますが、 「蛍光のクエンチ」だと特定の物理現象ですね。 間違いではないですが、誤解を避けるために使わないほうが無難。

(無題) 削除/引用 No.6660-15 - 2018/02/08 (木) 13:13:37 - AP いや、もとものそういう特定の現象を表す言葉というわけでもないので。 もとは「焼入れ」という意味で、そこから転じた、わりと日常的な言葉。

(無題) 削除/引用 No.6660-14 - 2018/02/08 (木) 13:08:28 - 774R 物理的に間違った意味で使われて定着した言葉なのかもしれませんね。 励起状態反応、エネルギー移動、錯体形成、衝突消光など https://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%B6%88%E5%85%89

(無題) 削除/引用 No.6660-13 - 2018/02/08 (木) 12:58:37 - AP >[Re:10] 774Rさんは書きました : > 生物学の分野でクエンチといえば、クエンチャーに代表されるように、可逆的な消光じゃないですかね？ > 不可逆的な変性とか分解はブリーチでしょう。 そりゃ、思い込みだと思うけどな。たとえば、自家蛍光の消光処理のことをquenchといったりするよ。 Google Scholarとかで用例をながめてみたら。

(無題) 削除/引用 No.6660-12 - 2018/02/08 (木) 12:54:08 - PoP https://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2009/May/Microscopy-and-Imaging-Techniques-Fluorescence-and-Immunofluorescence/biotechniques-142346.html?service=print 上記のサイトではクエンチも使われているけども。 ともかく、そこの情報は一助になるのでは。

(無題) 削除/引用 No.6660-11 - 2018/02/08 (木) 12:47:50 - 学生 APさん、AAさん、774Rさん、早速書き込みをありがとうございます！！ クエンチの意味についてしっかり確認せず使っています。すみません。 ＞固定はPFAなんかでやってから、クエンチのためのメタノール処理をしたらどうだろう。 その方法は思いつきませんでした。ぜひ明日、やってみます！ はい、transfectされた細胞は、抗体染色により同定する予定でいました。 transfection efficiencyも大変良い細胞なので、Alexa iFluor594が届けばすぐにデータは出そうなのですが、後学のため、今あるマテリアルでどこまでtroube shootできるかやってみます。ありがとうございます！ それ以外にこういった方法はどうか？などご提案ありましたら、どうぞ書き込みをよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.6660-10 - 2018/02/08 (木) 12:32:35 - 774R 生物学の分野でクエンチといえば、クエンチャーに代表されるように、可逆的な消光じゃないですかね？ 不可逆的な変性とか分解はブリーチでしょう。

(無題) 削除/引用 No.6660-9 - 2018/02/08 (木) 12:32:26 - AP 別に（笑）うことでもないがな。

(無題) 削除/引用 No.6660-8 - 2018/02/08 (木) 12:28:30 - AP GFP陽性を見分けるなら、光らなくしても抗体で検出しようとすればできる。大抵のラボには常備されてるんじゃないかな。 それこそ、固定などの処理の都合で光らなくなったGFPを検出するのによく使われる。

(無題) 削除/引用 No.6660-7 - 2018/02/08 (木) 12:23:47 - AP GFPがアルコールや有機溶媒で光らなくなるというのはよく知られた話だと思うけど。カバーグラスの縁を封じるマニキュアからの溶媒の漏れ込みでも影響をうけるといわれていた。 まあ、程度の問題で、大量に発現していたら少々死んでも十分に観察に耐えるかもしれないが、ベストコンディションではないかもしれない。それに近頃は蛍光強度を高めた変異体が色々あるので、条件が悪くても見えるのかもしれない。 クエンチ、言葉の定義の問題だが、間違いではないと思う。もともと特定の現象を指す専門用語というわけじゃないので。

(無題) 削除/引用 No.6660-6 - 2018/02/08 (木) 12:15:56 - 774R ただ、プラスミドによるアクチン骨格への影響を見るのが目的なら、トランスフェクションされた細胞とそうでない細胞を見分けるためにGFPが必要なんじゃないですかね？　GFPを消光させちゃったら本末転倒のような・・・ それとも、抗体でGFPを赤に染めて区別しますか(笑)

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