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グルタチオンビーズから溶出されません(ごめんなさい) トピック削除
No.7002-TOPIC - 2018/06/14 (木) 07:36:22 - 困ったさん。。
いつもいつも勉強させていただいています。

一月ほど前にも質問させてもらったのですが、その時にご回答いただいた先生方、心より感謝申し上げます。

ただ、やはり未だに格闘しています。もう無理かもしれないというところまで来ていますが、少し考えていることがあり、それをみなさんにお聞きしてもらえたらと思い、トピを立てました。

**********************
菌株:SoluBL21
IPTG: 0.5 mM
Temperature: 30˚C
Time: 4 hrs
Media: M9 defined media
Volume: 1 L x 2
**********************
Freeze and thaw x1

50 ug/ml Lysozyme
+ 1% Triton X100
+ 40 ug/ml DNase
+ 1 mM PMSF
in 20 mM Na phosphate buffer (pH 7.5)

1 hr, ゆっくり震盪、その後20,000xg, 10 min spin後の上清を可溶性画分とした
**********************
0.5 ml Ni-beads
+ 20 mM Imidazole

4度で一晩ローテーション

20 mM Imidazole in phosphate bufferで洗浄後、500 mM Imidazole in phosphate bufferで溶出(5ml)
**********************
20 mM Tris-HCl (pH8@25˚C)を5ml加え(2倍に希釈。)、0.5 ml分のGSH beadsを加え、6時間、4度でローテーション。

1000xg, 2 minでビーズを落とし、上清をアスピレートで吸引除去(*この時、繊維のような紐のようなものが浮遊していることに気づきました。たぶんタンパク質だと思います...)

(A)←*一月前に相談させていただいた内容です。
冷PBSで3回ほどビーズを洗浄し、適量のPBSに懸濁させたビーズをオープンカラムに移し、25 mM GSH in 50 mM Tris (pH 8)で溶出を試みましたが、たんぱく質は溶出されず、ビーズをSDSサンプルバッファーで処理すると目的のタンパク質ががっつり検出されました。(GSHビーズから溶出されない)

(B)冷PBSで3回ほどビーズを洗浄し、10ユニットのトロンビンをPBSに加え入れ、室温で16時間ゆっくり回転させました。結果は、上清にGSTが切断された目的のものが検出されることを期待しましたが、極わずかしか認められず、ビーズ側でGSTのバンドとGSTから切断されたバンドが検出されました。(つまりビーズ上でトロンビン切断されているけれど、ビーズから遊離されませんでした...)
**********************

一体どうすればモノが得られるか、途方に暮れています。

ただ最近一つ気づいたことがあります。
私のタンパク質はシアル酸を認識するCタイプレクチンで、ある糖タンパク質(リガンド)を認識し、結合します。ただ最近になり、このCタイプレクチンはシス相互作用する報告がなされました。つまり、このCタイプ
レクチン同士で結合する、という報告がBIACOREの実験やカロリーメーターの実験などで証明されました。

そこで今考えていることは、GSHビーズ上で高濃度でタンパク質が集まるため、シス相互作用によりタンパク質凝集してしまったのではないか?と考えました。もしかしたら、GST精製の時点で遊離シアル酸を加えることでひょっとしたら上手に精製できるのではないか、凝集が抑えられるのではないかと考えました。

このようなことはうまくいくでしょうか?もし前例がありましたらシェアしていただけますと本当に嬉しいです...よろしくおねがいいたします。
 
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57件 ( 1 〜 20 )  前 |  1/ 1. 2. 3. /3


(無題) 削除/引用
No.7002-57 - 2018/07/21 (土) 05:01:22 - おお
シアル酸が関係しているということならおそらく細胞外や表面にあるタンパク質かそういうところにさらされている部分だろうから、分泌系の発現系がいいのかなという気もします。

大腸菌にもあるようですが、他には
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4047484/
https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-expression/yeast-protein-expression/pichiapink-yeast-expression-systems.html

(無題) 削除/引用
No.7002-56 - 2018/07/18 (水) 12:26:20 - SYBR master
今回もon columnで切断しても溶出できないのでしょうか?

PAGEを見ても、ここまで汚いw、精製後のグルタチオンセファロースを見たことが無いので、目的のタンパク質はそれが保持している疎水性部分や、抽出時における変性に伴って他のタンパク質を巻き込んで凝集し、そのときセファロースも巻き込んで吸着しているものと思われます。

1. 精製の順番を入れ替えて、GSTからまず精製しましょう。そこで凝集を押さえることができればその後にHis-Tagも同じ方法で凝集を押さえれるかもしれません。

2. 凝集を押さえるために界面活性剤を試す(濃度、種類)のが一般的ですが、特に活性などを残したいのであれば、両性か非イオンの特にアルキルグルコシド系の高価な界面活性剤を試すことになると思います。しかし、種類も多く条件設定が膨大になり、面倒だしお金も掛かるのでお勧めしません。

3. 界面活性剤の他には、a)アルギニン, b) non-detergent sulfobetaine (NDSB), c)トレハロースが有効なことがあると報告されています。これらは比較的安価であるにもかかわらず、濃度の変更だけで効果がでますが、どれが効くかは残念ですが試してみるしか有りません。

4. アルギニンは個人的には上手くいったためしがないのでおいておくとして、初手としてはNDSBをお勧めします。NDSBも5種類くらい有りますが、Merckから一般的によく使われている3種類NDSB-195, -201, -256の3種類がセットになっている物があります。使い方はMerckのHPに日本語冊子のpdfが有りますのでそれを参考にすると良いかと思います。

5. トレハロースですが、効果についてはNDSB同様にタンパク質変性の抑制効果があり、実際にタンパク質やエクソームの保存等に利用されています。試すだけなら食品添加物の「トレハ」でも純度はほぼ同じで安価\1,000/kg位だったきと思います。

6. NDSBもトレハロースも、とりあえずf.c. 0.5 Mで試してみてください。NDSBもトレハロースも0.5 M程度までならDNaseの活性を阻害しませんので、状況から考えて抽出バッファーに最初から入れておく方が良いと思います。また、NDSBもトレハロースも、アフィニティーカラムへ目的タンパク質の吸着阻害はこれまで経験していませんので、そのままカラムにアプライできます。wash bufferにも入れておいた方が無難です。

以上、ご参考になれば

(無題) 削除/引用
No.7002-55 - 2018/07/17 (火) 22:04:51 - xxx
シアル酸の標的となるタンパク質というわけではないので、凝集抑制効果は望めないのでは?
ヒドロキシ基による凝集抑制効果を望むのであれば、古くから使われているグリセロールや多価アルコールで良いわけだし。

(無題) 削除/引用
No.7002-54 - 2018/07/17 (火) 18:58:19 - み
横からで悪いけどシアル酸って結構高価だよ
第一選択肢ではないってことじゃない?
このトピの内容ほとんど読んでないからよく分らんが

(無題) 削除/引用
No.7002-53 - 2018/07/17 (火) 16:04:02 - どい
>doi
きも・・・必死・・・笑

(無題) 削除/引用
No.7002-52 - 2018/07/17 (火) 12:27:34 - doi
何度も繰り返しになりますが、凝集を抑制するために遊離シアル酸を加えるのはどうかという質問をしたにもかかわらず、それを試そうとしないのはなぜですか。
それが正解かどうか走りませんが、いろいろな助言をもらっておいて、自分のアイデアを実行しないのは不誠実ではないですか。

(無題) 削除/引用
No.7002-51 - 2018/07/15 (日) 19:27:18 - おお
そうそう、収量も実測値が共存するものを含めたものであれば、共雑物を除くと10分の1ぐらいですよね。

(無題) 削除/引用
No.7002-50 - 2018/07/15 (日) 19:19:45 - おお
ところで大腸菌はどうしてます?グリセロールストックからそのまま増やしているとか?

(無題) 削除/引用
No.7002-49 - 2018/07/15 (日) 19:14:56 - おお
>ヒスタグで一度精製しているので、GSTでワークしなければ他の精製手段はありません...

要するに使えるかどうかも分からないものを精製しているということになりませんか?その次の手段があるのなら、GSTタグがついていてもそのステップをスキップして精製することができるわけですし、その時点でグルタチオンビーズを使う必要がないと思えるならそれでいいわけですし。

そういうストラテジーがない中で使えないかもしれないものを精製しているという風に見えます。


示された結果で思うのは大腸菌での発現量がそんなに強くなさそうですね。あるいは不溶画分にいっているか。大量精製には向いてないと思える結果です。

最初からほかのタンパクを巻き込みアグッてたものがNiカラムで溶出されてないかなと思えます。

ところで今まで溶出できなかったレジンを保存してますか?うまく溶出できるプロトコールが見つかるとすればそれらはまだ使えるはずだし。

(無題) 削除/引用
No.7002-48 - 2018/07/15 (日) 17:22:09 - cDNA
繰り返しになって申し訳ないのだけれども、Ni-NTAもGSHもGEのもので、恐らく基材が同じだと、挙動が違う事に違和感が大きいんですよね。

GSHの方もリン酸バッファーを使ってはどうですか?確かにpH8以上でTrisの方が緩衝能は高いですが、リン酸バッファーでも作ることは出来ます。

NiカラムでTrisを使ったことはありますか?それで問題無ければ、私の指摘は的外れと言えるでしょうが。

また、精製度の事を考えるなら、Niカラムでいきなり500mMで溶出するのではなく、グラジエントだったり、溶出しない高めのイミダゾール濃度を挟むことで、精製度は上がると思います。

(無題) 削除/引用
No.7002-47 - 2018/07/15 (日) 09:21:54 - タンパク質初心者
おお様、

浅はかな自分の質問に、それでも何度も書き込みをくださり、心から感謝しています。
本当にありがとうございます。。

前にうまく行っていたスケールは、大腸菌1Lから125マイクログラム取れました。
今回は10Lから50マイクログラム(それも目的のモノ以外の夾雑物も含まれています。)です...。

> 同じスケールで繰り返し必要量を得るのはスケールアップでのトラブルを回避する最善の方法です

すみません、前の書き込みに注視していなかったようです。本当にバカですね。
なるほど...うまく行っている系でスモールスケール繰り返しして、最後に合わせればいいのですね。なるほど...

> プロトコールにも微妙なちがいがあります。うまくいった時はいちど25mMのGSHで洗って(溶出を試みて)からGSH濃度をあげてますよね。

はい、ラージスケールにしてから今回もそのように行いました。が、だめでした。60mMでもだめで、100mMでもしたのですが、だめでした。10分は室温で転倒混和させていましたが、全く溶出されずでした。

> 菌株はBL21に戻したんじゃなかったっけ。

菌株はどちらの株でも同じ現象でした。

> いっそのことこんど溶出できなかったら100mMぐらいのGSHをレジンにくわえてOver nightぐらい4度で放置してみればどう?

そうですね。。。今、Sオクチルグルタチオンを注文しようとしていますので、その際に一緒に検討してみます。

> 12.5mM GSH存在下でタンパクはつかないのに溶出では12.5mMではできないので、タンパクの性質が変わってしまってますよね?懸念材料ではないですか?

やはりそうですよね!?そうなんです...20mMグルタチオンを結合バッファーに入れると、モノはビーズに結合を示さないので、結合した後で目的のタンパク質の性質が変わっているんです。そう考えていましたが、そんなことって...?と懐疑的でした。ただ、おお様にそのように指摘され、やはり性質が変わってしまった可能性が大なのだと思いました。はい、懸念材料です。

> 溶出できてもまだ汚いようなのですがその後どうやって精製をするのですか?その方法論が定まっているならGSHビーズをスキップしてその方法を使う手もあるでしょう。

ヒスタグで一度精製しているので、GSTでワークしなければ他の精製手段はありません...

> GSTカラムって結構きれいになるんだけどなんかちょっと不思議な気がしています。

そうなんですね...なぜだろう。

ttps://i.imgur.com/NP9xhuK.jpg


画像、アップロードしました。よければ見ていただけますと幸いです。
赤矢印の55kDのタンパク質がGST融合タンパク質です。
これは10Lの大腸菌培養から50マイクログラムを最終的に”精製”したものです。が、精製したものはとてもじゃないですが、綺麗になっていませんし、これ、最終的な溶出液の1/20をアプライしていますが、全く採れていません。ほとんどがビーズに残っています(最終レーン)。しかもそのビーズにもそれ以外のいろんなバンドが見られています。。

(無題) 削除/引用
No.7002-46 - 2018/07/15 (日) 05:46:42 - おお
望み薄なので書き込むのはやめようと思ってましたが、

前にうまく言ったときのスケールでどれくらいの量取れましたか?同じスケールで繰り返し必要量を得るのはスケールアップでのトラブルを回避する最善の方法です(これは前にもアドバイスがあったはず)。

プロトコールにも微妙なちがいがあります。うまくいった時はいちど25mMのGSHで洗って(溶出を試みて)からGSH濃度をあげてますよね。

菌株はBL21に戻したんじゃなかったっけ。

いっそのことこんど溶出できなかったら100mMぐらいのGSHをレジンにくわえてOver nightぐらい4度で放置してみればどう?

12.5mM GSH存在下でタンパクはつかないのに溶出では12.5mMではできないので、タンパクの性質が変わってしまってますよね?懸念材料ではないですか?

溶出できてもまだ汚いようなのですがその後どうやって精製をするのですか?その方法論が定まっているならGSHビーズをスキップしてその方法を使う手もあるでしょう。

GSTカラムって結構きれいになるんだけどなんかちょっと不思議な気がしています。

(無題) 削除/引用
No.7002-45 - 2018/07/14 (土) 20:52:28 - タンパク質初心者
cDNAさま、

この度は再度コメントをいただき、ありがとうございます。嬉しいです。。

> また、先にGSHを入れておいて結合しない時のビーズをSDS-PAGEで調べたことはありますか?

はい、ビーズをサンプルバッファーで処理して、GSHを加えていた時にはほとんどなにも結合していませんでしだ。

レジンの量を減らすですか。。私は確かに過剰なレジンを使っているも思います。
1mgも精製できたら御の字ですが、75%のGSHレジンを500から1000microリットル使っています。多すぎでしょうか。。

> S-butylglutathioneは販売中止になっているようですが、S-Octylglutathioneは売られているようです。

ありがとうございます。多くの研究者が溶出に困難を抱えている、と書かれていますね。一緒です。今は論文が見れない環境ですが、ラボに行ったら論文見てみます。本当にありがとうございます。

実はもうだめだろうと見切りをつけ、MBP融合タンパク質発現系に変えようとしていたところです。cDNAさまのコメントをお聞きして、もう少し改善の余地がありそうだと、かんじています。

(無題) 削除/引用
No.7002-44 - 2018/07/14 (土) 16:00:30 - cDNA
以前の指摘にあったように、なぜ6時間にこだわるのでしょうか。結合しやすいものは混ぜて撹拌した時にはほぼ結合しているものです。15分ぐらいでやることの方が多いと思います。

また、先にGSHを入れておいて結合しない時のビーズをSDS-PAGEで調べたことはありますか?もし余計なタンパク質がかなり吸着していれば、その後にバッファー交換してビーズに付けるとそのままプルダウンに使えるようになるかもしれません。(たぶんそんなに都合のいいことはありませんが)

私ならとりあえずレジンの量を大げさに減らしますね。

自分の勉強のために色々調べてみたら、こんな論文もありました。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20849958

S-butylglutathioneは販売中止になっているようですが、S-Octylglutathioneは売られているようです。

ごめんなさい...助けてくださいm(_ _)m 削除/引用
No.7002-43 - 2018/07/14 (土) 03:59:48 - タンパク質初心者
トピ主です。ごめんなさい...助けてくださいm(_ _)m

再三あげてしまい、大変恐縮しています。また一度は解決したかに見えましたが、だめでした。
もしご容赦いただけるのなら、どうか再度ご相談に乗ってくださると幸甚です...。

問題:還元型グルタチオンを加えても、グルタチオンビーズからGSTタンパク質が溶出されません。

以下が、簡略化したこれまでのステップです。

SoluBL21株において、IPTG 0.5 mM, 4 hrs, 30度でタンパク質発現誘導

その後、一旦ペレットを凍結したのち、解凍後、ライソザイム、Tx100、DNase、PMSF(リン酸バッファー)で温和に溶菌

遠心後の上清に終濃度20mMイミダゾールとニッケルビーズを加えて、6時間、4度で転倒混和させました。

オープンカラムに全てをアプライし、担体を500mM塩、1%Tx100を含む20mMイミダゾール(リン酸バッファー)で洗浄、その後、500mM塩、1%Tx100を含む500mMイミダゾール(リン酸バッファー)で溶出しました。この時、溶出液は12mlあります。

次に、そこへ直接グルタチオンビーズを加え入れ、6時間、4度で転倒混和させました。

その後、500mM塩、1%Tx100を含む60mM還元型グルタチオン(トリスバッファー。グルタチオン溶解後pH8.5は確認済です。)で溶出を試みました。

結果、全く溶出されておりません。前にここでアドバイスをいただき、500mM塩、1%Tx100、60mMグルタチオンで溶出されたのですが、それが再現できませんでした。その時との違いは、精製スケールです。前回はたった500ulから精製を行いましたが、今回は12mlにまで増やして行っています。

目的のタンパク質はがっつりGSHビーズについたままでした。
GSHではまったく溶出されていません。GSHを100mMにまであげてもみたのですが、それでもだめでした。

また、GSHビーズと混和前に、そこに還元型グルタチオンを20mM程度でも入れておくと、僕の目的のタンパク質はまったくビーズに結合しなくなるので、GSTタンパク質と、GSHビーズとの結合は特異的なものであることが確認されています。


どうにかこのGSTタンパク質を精製したいです...ビーズをSDSでボイルをすると、目的のもの以外のタンパク質もベタベタついていることがわかっているので、一度、GSHで溶出し、綺麗にしたものを再度新しいGSHビーズにつけ、アフィニティクロマトを行いたいです。。

どうか、どうか助けてください。どうしたらGSHビーズから外すことができるでしょうか。。。

ありがとうございました。 削除/引用
No.7002-42 - 2018/06/26 (火) 13:02:36 - タンパク質初心者
CDNA先生、おお先生、

cDNA先生からコメントいただき、早速高濃度GSHを試してみました。

結果、なんと溶出されました。。。涙が出ました。本当にありがとうございました。心から感謝しています。

行なったこととして、

これまで、50mMトリス、150mM塩で洗浄、その後25mMのGSHを洗浄液に加え入れトリスにてpHを8に合わせたものを溶出バッファーとしていましたが、これでは全く溶出されませんでした。

今回、上記洗浄バッファーで洗浄し、さらに上記使えない溶出バッファー1mlで5分くるくるチューブを回転させたのち、遠心、上清を確認するとやはり何も溶出されずでした。

次にそのビーズに、500mM塩、1%Tx100、60mMのGSHを加えてpHをトリスで8.5にしたものを溶出バッファーとして使用したところ、目的のバンドがぼこっと出てくれました。。cDNA先生、おお先生、みなさま、本当にありがとうございました。コンストラクトを見直そうと考えていたところでしたので、それをする必要もなさそうで本当に嬉しいです。

ただ、目的のバンド以外にも多くのバンドが出ていますので、今後、最後の条件検討として、

洗浄バッファーに1%Tx100を入れ、疎水性相互作用によりノンスペを減らす。500mM塩を加えることで静電気的な相互作用によるノンスペを減らす、以上を行おうと思います!!その後、同改良洗浄バッファーに60mMという高いGSHをぶち込むことで単一なものを得ようと思います!!!!!

みなさま、先生方、この度は長くお付き合いしていただき、本当にありがとうございました。
随分と時間がかかりましたが、大腸菌の可溶化から始まり、TAPの落とし穴、トラブルシュートをこれほどたくさん学べたことは大変有益でした。タンパク質初心者ではありますが、知らなくてはならないことも知らず、身の程しらずでしたが、これからはきちんと基礎のベースを固めて行くように心がけることにします。

再三になりますが、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.7002-41 - 2018/06/25 (月) 09:28:42 - おお
前にも書いたけどヘパリンカラムのレジンとか使ってみる気はないのかな。

(無題) 削除/引用
No.7002-40 - 2018/06/25 (月) 09:24:31 - おお
www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/gst-antibody/2622
www.abcam.com/gst-antibody-epr4236-ab111947.html#description_images_2
www.thermofisher.com/antibody/product/GST-Tag-Antibody-clone-8-326-Monoclonal/MA4-004
www.thermofisher.com/antibody/product/GST-Tag-Antibody-Polyclonal/A-5800
www.scbt.com/scbt/product/gst-antibody-a-6?requestFrom=search
www.scbt.com/scbt/product/gst-antibody-b-14
www.scbt.com/scbt/product/gst-antibody-56c1?requestFrom=search
www.scbt.com/scbt/product/gst-antibody-3d4?requestFrom=search
www.scbt.com/scbt/product/gst-antibody-1e5?requestFrom=search

(無題) 削除/引用
No.7002-39 - 2018/06/25 (月) 08:48:55 - cDNA
アグっていることを想定しないなら、基本に立ち返るのが一つかと思います。
GSHで結合が抑えられたのは朗報ではないでしょうか。

取説の、溶出しない場合を見ると
GSHを40mMまで上げる
pHを8-9まで上げる
界面活性剤を入れる
塩濃度を上げる

などが記載されていますが、上二つはまだ試していないのではないでしょうか。
GSHも新品を使いましょう、とありますので、バッファー類を全て新調する、というのも行き詰った時によくやります。

(無題) 削除/引用
No.7002-38 - 2018/06/25 (月) 08:37:48 - タンパク質初心者
おお先生、

その方法を使いたいのですが、GST抗体で免疫沈降に使えるものは探してもありませんでした。
GSTを細胞外に向いて発現するタンパク質は所持するGST抗体ではフローサイトに使えませんでしたので...

土井先生、

>いや、だからアグっている理由がシス相互かもしれないと自分で最初から言っているわけだから、シアル酸添加をやってみればいいじゃないですか。

そうなんですよね...ただ半年ほど前に0.5mgのモノを、14Lの大腸菌から精製できていますので、今思えばシス相互でアグル可能性は低そうです。

今別のコンストラクトを作成予定です。
GSTはやめて別のタグで。。C末は従来通りヒスタグで、N末には何タグを持ってこればいいでしょうか?

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