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グルタチオンビーズから溶出されません(ごめんなさい) トピック削除
No.7002-TOPIC - 2018/06/14 (木) 07:36:22 - 困ったさん。。
いつもいつも勉強させていただいています。

一月ほど前にも質問させてもらったのですが、その時にご回答いただいた先生方、心より感謝申し上げます。

ただ、やはり未だに格闘しています。もう無理かもしれないというところまで来ていますが、少し考えていることがあり、それをみなさんにお聞きしてもらえたらと思い、トピを立てました。

**********************
菌株:SoluBL21
IPTG: 0.5 mM
Temperature: 30˚C
Time: 4 hrs
Media: M9 defined media
Volume: 1 L x 2
**********************
Freeze and thaw x1

50 ug/ml Lysozyme
+ 1% Triton X100
+ 40 ug/ml DNase
+ 1 mM PMSF
in 20 mM Na phosphate buffer (pH 7.5)

1 hr, ゆっくり震盪、その後20,000xg, 10 min spin後の上清を可溶性画分とした
**********************
0.5 ml Ni-beads
+ 20 mM Imidazole

4度で一晩ローテーション

20 mM Imidazole in phosphate bufferで洗浄後、500 mM Imidazole in phosphate bufferで溶出(5ml)
**********************
20 mM Tris-HCl (pH8@25˚C)を5ml加え(2倍に希釈。)、0.5 ml分のGSH beadsを加え、6時間、4度でローテーション。

1000xg, 2 minでビーズを落とし、上清をアスピレートで吸引除去(*この時、繊維のような紐のようなものが浮遊していることに気づきました。たぶんタンパク質だと思います...)

(A)←*一月前に相談させていただいた内容です。
冷PBSで3回ほどビーズを洗浄し、適量のPBSに懸濁させたビーズをオープンカラムに移し、25 mM GSH in 50 mM Tris (pH 8)で溶出を試みましたが、たんぱく質は溶出されず、ビーズをSDSサンプルバッファーで処理すると目的のタンパク質ががっつり検出されました。(GSHビーズから溶出されない)

(B)冷PBSで3回ほどビーズを洗浄し、10ユニットのトロンビンをPBSに加え入れ、室温で16時間ゆっくり回転させました。結果は、上清にGSTが切断された目的のものが検出されることを期待しましたが、極わずかしか認められず、ビーズ側でGSTのバンドとGSTから切断されたバンドが検出されました。(つまりビーズ上でトロンビン切断されているけれど、ビーズから遊離されませんでした...)
**********************

一体どうすればモノが得られるか、途方に暮れています。

ただ最近一つ気づいたことがあります。
私のタンパク質はシアル酸を認識するCタイプレクチンで、ある糖タンパク質(リガンド)を認識し、結合します。ただ最近になり、このCタイプレクチンはシス相互作用する報告がなされました。つまり、このCタイプ
レクチン同士で結合する、という報告がBIACOREの実験やカロリーメーターの実験などで証明されました。

そこで今考えていることは、GSHビーズ上で高濃度でタンパク質が集まるため、シス相互作用によりタンパク質凝集してしまったのではないか?と考えました。もしかしたら、GST精製の時点で遊離シアル酸を加えることでひょっとしたら上手に精製できるのではないか、凝集が抑えられるのではないかと考えました。

このようなことはうまくいくでしょうか?もし前例がありましたらシェアしていただけますと本当に嬉しいです...よろしくおねがいいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.7002-41 - 2018/06/25 (月) 09:28:42 - おお
前にも書いたけどヘパリンカラムのレジンとか使ってみる気はないのかな。

(無題) 削除/引用
No.7002-40 - 2018/06/25 (月) 09:24:31 - おお
www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/gst-antibody/2622
www.abcam.com/gst-antibody-epr4236-ab111947.html#description_images_2
www.thermofisher.com/antibody/product/GST-Tag-Antibody-clone-8-326-Monoclonal/MA4-004
www.thermofisher.com/antibody/product/GST-Tag-Antibody-Polyclonal/A-5800
www.scbt.com/scbt/product/gst-antibody-a-6?requestFrom=search
www.scbt.com/scbt/product/gst-antibody-b-14
www.scbt.com/scbt/product/gst-antibody-56c1?requestFrom=search
www.scbt.com/scbt/product/gst-antibody-3d4?requestFrom=search
www.scbt.com/scbt/product/gst-antibody-1e5?requestFrom=search

(無題) 削除/引用
No.7002-39 - 2018/06/25 (月) 08:48:55 - cDNA
アグっていることを想定しないなら、基本に立ち返るのが一つかと思います。
GSHで結合が抑えられたのは朗報ではないでしょうか。

取説の、溶出しない場合を見ると
GSHを40mMまで上げる
pHを8-9まで上げる
界面活性剤を入れる
塩濃度を上げる

などが記載されていますが、上二つはまだ試していないのではないでしょうか。
GSHも新品を使いましょう、とありますので、バッファー類を全て新調する、というのも行き詰った時によくやります。

(無題) 削除/引用
No.7002-38 - 2018/06/25 (月) 08:37:48 - タンパク質初心者
おお先生、

その方法を使いたいのですが、GST抗体で免疫沈降に使えるものは探してもありませんでした。
GSTを細胞外に向いて発現するタンパク質は所持するGST抗体ではフローサイトに使えませんでしたので...

土井先生、

>いや、だからアグっている理由がシス相互かもしれないと自分で最初から言っているわけだから、シアル酸添加をやってみればいいじゃないですか。

そうなんですよね...ただ半年ほど前に0.5mgのモノを、14Lの大腸菌から精製できていますので、今思えばシス相互でアグル可能性は低そうです。

今別のコンストラクトを作成予定です。
GSTはやめて別のタグで。。C末は従来通りヒスタグで、N末には何タグを持ってこればいいでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.7002-37 - 2018/06/24 (日) 14:31:49 - doi
いや、だからアグっている理由がシス相互かもしれないと自分で最初から言っているわけだから、シアル酸添加をやってみればいいじゃないですか。

(無題) 削除/引用
No.7002-36 - 2018/06/24 (日) 11:05:51 - おお
もしそのままやるなら、Niで精製したものをプルダウンしたい溶液に混ぜて、しばらくおいてからAnti-GSTでプルダウン。

すみません、解釈を間違えました。 削除/引用
No.7002-35 - 2018/06/24 (日) 07:28:04 - タンパク質初心者
すみません、データの解釈を間違えました。

×
次に、結合バッファーに12.5mMのGSHを加えたら、そもそもビーズに結合しなくなるのでは?とコメントいただいたので検討したところ、最悪なことにGSH存在下でもそのタンパク質はビーズに結合してしまっていました。


次に、結合バッファーに12.5mMのGSHを加えたら、そもそもビーズに結合しなくなるのでは?とコメントいただいたので検討したところ、GSH存在下ではそのタンパク質はビーズに結合していませんでした。


以上のことから、GST融合タンパク質のGSHビーズへの結合は特異的であると考えます。
つまり精製中にアグってしまってもうどうしようもなくなるみたいですね。

GSTタグは諦めます。

C末のヒスタグは残しておいて、C末にはStrepTagIIタグを持たせてみます。

ただこの場合、コントロールの組替えタンパク質はどうしたらいいでしょうか?
これまででしたら、コントロールの組替えタンパク質としてGSTそのものが利用できたのですが..

(無題) 削除/引用
No.7002-34 - 2018/06/24 (日) 05:12:39 - おお
>もっと長くPBS等のバッファーか、イミダゾール含む溶出バッファーで平衡化を一時間ほどしておくべきでしょうか??

意味があると思えませんが、、、

結果です。 削除/引用
No.7002-33 - 2018/06/24 (日) 04:43:07 - タンパク質初心者
この度はGST-タンパク質X-His6の大腸菌での発現ではお世話になっております。
この数日行なった実験結果をお知らせさせてください。

SoluBL21をM9培地でタンパク質誘導後(4時間)、トリトンX100とライソザイムで可溶化、その後ニッケルでうまく精製できるのですが、イミダゾール溶出液にGSHビーズを加えると、その後グルタチオンで溶出されない原因がわかりましたので、お伝えさせてください。

まず、SoluBL21ではなく、成功例のあるBL21に戻し、さらに成功例のあるLB培地で誘導を行いました。
結果、何も変わらず、GSHビーズから溶出されませんでした。

次に、結合バッファーに12.5mMのGSHを加えたら、そもそもビーズに結合しなくなるのでは?とコメントいただいたので検討したところ、最悪なことにGSH存在下でもそのタンパク質はビーズに結合してしまっていました。

つまりそのタンパク質は、GSHとのアフィニティではなく、ビーズに非特異的に吸着してしまっていました。


問題がわかったので、これをどうするか悩んでいます。
ビーズはボトルからいつもPBSで一度洗ってエタノール等を除いたものを直接イミダゾール溶出液に加えていますが、もっと長くPBS等のバッファーか、イミダゾール含む溶出バッファーで平衡化を一時間ほどしておくべきでしょうか??

(無題) 削除/引用
No.7002-32 - 2018/06/19 (火) 18:15:17 - cDNA
アドバイスが増えるほど混乱する様にも思うのですが、いろいろと思い込みが激しいようにも感じます。

実はpH7.5と8の差が如実に出てしまったという事はないですかね。
(糖を入れてみるのも面白そうです。独り言ですが)

また、ニッケルカラムで精製出来るのはいいとして、ほぼ入れた分だけ回収できていますでしょうか。濃度を合わせてSDS-PAGEで確認しているのか気になりました。

(無題) 削除/引用
No.7002-31 - 2018/06/19 (火) 16:31:24 - おお
ん、もしかしてヘパリンカラムにつくって事はないか?

(無題) 削除/引用
No.7002-30 - 2018/06/19 (火) 15:04:01 - タンパク質初心者
おお先生、

よく理解することができました。
ありがとうございます。
このタンパク質は2型膜タンパク質で、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインのいずれも組換えタンパク質のデザインから省いています。細胞外ドメインのみをGSTをN末にHisをC末につけたものを今回作成しています。


今、SoluBL21+defined M9 mediaではなく、オリジナルのBL21に戻しかつLB培地でもう一度だけ最初に戻ってタンパク質を精製できないかみてみます。それでだめならドメインダイゼクションを行ってみます。
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.7002-29 - 2018/06/19 (火) 14:52:10 - おお
ところでそれって膜貫通ドメインを持っているのですか?持っていたとして、そういうものを全長でリコンビナントを作る意味はなんですか(全長でやっていれば)。

(無題) 削除/引用
No.7002-28 - 2018/06/19 (火) 11:24:51 - おお
いまのコンストラクトでゲル上でアグルわけだから、例えばN末半分のをHisx6とGSTでラベルしたものと残りのC末で同様にタグをつけたものを用意すると、可溶性が高くなり精製しやすくなるということ。ドメインダイセクションとかいたのは分けるところがドメインの真ん中じゃなくって構造的ドメインで区切るのがベターだから。これでN末とC末両方うまく精製できるようだったら、それぞれでPull downすれば、結合するものだけじゃなくどの部分に結合するという細かい考察もできる。

もちろんあるドメインだけを狙ってそれだけを切り取ってきてHisx6とGSTでラベルしてもいいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.7002-27 - 2018/06/19 (火) 09:22:25 - タンパク質初心者
おお先生、

ドメインダイゼクションというのは、現在問題を抱える組み換えタンパク質につき、ドメインを削り、その影響(この場合は機能的なタンパク質として発現精製されるか)を、オリジナルのタンパク質と比べる、ということでしょうか?つまりデリーションミュータント作りでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.7002-26 - 2018/06/19 (火) 08:53:07 - おお
ドメインダイセクションって具体的にどうするか伝わったかな。。。

(無題) 削除/引用
No.7002-25 - 2018/06/19 (火) 07:02:14 - タンパク質初心者
moz先生、

亜鉛や鉄は必要ないようです。

そうですよね...今、可溶性発現に成功したLB培地に戻して増やしているところです。

たくさん時間を浪費しました。
問題解決のために本当に大事なことが見えていませんでした。
M9はLBに勝るはず、そのためにSoluBL21まで購入したのだから、、ということにこだわり過ぎました。

先生方、素人の私に気づかせてくださりありがとうございます。

結果はまた追ってお伝えさせていただければと思います。

(無題) 削除/引用
No.7002-24 - 2018/06/19 (火) 06:31:37 - moz
マニュアルに記載のM9 defined mediaにはZn, Feが含まれていませんが、目的タンパクはZn FingerタンパクのようにZnのような特別なイオンが活性に必要とかの知見はないですか。
または、SoluBL21株を使うにしろ、可溶性発現に成功した培地に戻した方が問題解決には早いかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.7002-23 - 2018/06/19 (火) 02:25:10 - タンパク質初心者
おお先生、

分解物か夾雑物かについては、ウエスタンで特異的な抗体やタグに対する抗体で見た結果では、SDSサンプルバッファーでビーズから溶出されたサンプルではスメアには現れなかったので、分解産物ではないと思っています。

> GSTをつけるほうが可溶性があがるので、よく使われるという話で必須ではないです。ほかに可溶性をいじするのにGFPなどが使われることがあるようです。

ありがとうございます。一度タグなしのものを作製してみます。

> コンストラクトを作るなら、ドメインダイセクションをするというのも手かもしれません。Y2Hなどは同時に走らせたりしてないのですか?

走らせていないです...

(無題) 削除/引用
No.7002-22 - 2018/06/19 (火) 02:23:01 - タンパク質初心者
cDNA先生、doi先生

> 塩にこだわっていて悪いのですが、今回のグルタチオンでの溶出のバッファーに150mMの塩は入っていますか?結合の時にも入っていた方がいいですが、溶出にこそ必要です。Tritonを気にするなら、これも溶出バッファーに入れてもいいと思います。

今回、結合にも溶出にも1%Tx100と500mM塩を入れていますが、それでもグルタチオンでは溶出されませんでした。

> 前トピなどを読んでみるとGEのレジンのようですが、二つともGEのものでしょうか?

はい、どちらもGEのものです。
ただし、GSHビーズの使用期限は2008年とかなり古いものです。
ただこれでGST単独のものやそれ以外のGST融合タンパク質は精製できていますので、きちんとワークすると考えています。



>その可溶性に来たものは本当にnativeのものですか、変成蛋白が凝集せずにわずかに可溶性を示しているだけではないですか。

その可能性は確かにありますね...
ただ以前、同じコンストラクトを(SoluBL21ではなく)BL21で通常のLBでタンパク質発現誘導させた場合はきちんと機能的なものが可溶性画分から回収されています。今回、SoluBL21を使ってdefined M9 mediaだとこのような結果になっています。もしかしたら菌種や培地の成分により、可溶性のタンパク質が変性しているといいますか、ただしいGST構造をとっていない可能性もあるかもしれません...

>可溶性画分にニッケルビーズを加え一晩転倒混和
なぜ一晩も行うのですか。変性と分解のリスクを考えていますか。

すみません。一晩をデフォルトにしていました。
4度で数時間も行えば大丈夫なのでしょうか?

>タンパク質の組替えタンパク質を作る際、親和性をあげるタグをつけることは必須でしょうか?
必須ではありません。

ありがとうございます。そうなのですね。

>目的のGST融合タンパク質を含む溶液にGSHビーズを混ぜるときにグルタチオンを加えておくとどうなりますか。つまり最初から溶出条件で混ぜるとどうなりますか。それでもビーズに目的蛋白質が吸着するならば、目的のタンパク質はビーズとは非特異的吸着しているに過ぎないと言えます。

結合時にグルタチオンを入れておくことは検討したことがありません。これはぜひ検討してみます。ありがとうございます。

>ところで、最初の質問はシアル酸を加えるとどうなるかだったはずですが、なぜさっさとそれをやってしまわないのですか?

理由は試薬がないからなのですが、まずそれ以外のことで検討してみます。ありがとうございます。

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