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Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について トピック削除
No.7755-TOPIC - 2019/03/11 (月) 17:52:12 - アップルキッド
Somogyi-Nelson法を用いてある酵素の活性を測定していますが、ここ最近、実験の再現性が取れなくて困っております。


実験は以下の様な流れで行なっています。
@酵素を規定の濃度に希釈して基質と反応させる。
A酵素反応終了後、ソモギー銅液(和光から購入)を加えて20分間煮沸。
Bネルソン試薬(シグマから購入)を加え、比色分析。STDの検量線より還元糖の濃度計算。

今までと同様の手順で行なっているのですが、吸光度の数値のバラつきが大きかったり、酵素の添加濃度が異なる(生成される還元糖の濃度が異なる)のにも関わらず同じ様な吸光度の数値が出たりします。

ソモギー銅液とネルソン試薬ですが、以前から開封後3、4ヶ月経過すると数値の再現性に影響することが多々あったので、新品を購入して再度測定しましたがバラつきが収まることはありませんでした。


私のテクニカル的な問題(ピペッティング技術など)を抜きにして、何か原因が考えられますでしょうか?ソモギー銅液とネルソン試薬はすぐに劣化するものなのでしょうか?
この様な経験やアドバイスがありましたら、ご教示下さい。


ちなみにですが…

酵素反応の関係上、通常Somogyi-Nelson法で用いられるビー玉試験管では無く、スクリューキャップ付きマイクロチューブを使用しています。
煮沸前後で体積が大幅に変化している訳では無いので、煮沸中に水が入り込んだことが原因とは考えられません(それ以前にも同様の手法でやっており再現性が取れていたので…)。

また、本来はネルソン試薬を加えたら発色の安定を待つ為に30分程度置きますが、研究室の慣例的に待たずに測定しております(個人的に即測定するのはどうかと思うのと、準備に手間取るのでだいたい15分後ぐらいに測定しています)。
 
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(無題) 削除/引用
No.7755-16 - 2019/03/18 (月) 22:46:55 - cDNA
検量線については、還元糖なしをブランクとして引いているのでしょうか?こういうものは引くのが正しいと一概には言えないのですが、引くことによって直線に乗るなら、そちらを採用したらいいと思います。


前任者の条件を完全に信じていいかは、何とも言えません。前任者が正しいか、何か間違っているか、間違った記述を残しているか、本当のところは分かりません。

いろんな問題を解決するには必要を思われる範囲を超えて条件を振るしかないと思いますが、その辺は指導者と相談するのが一番だと思います。

実験以外で検証が必要な部分としては、基質量が間違っていないか、というところでしょうか。極端な例としては酵素量を増やしても、基質が消費され切っていれば、それ以上には生成物も上がらないので。

基質を自分で調製したということなので、濃度を間違っていないか、もしくは間違っているかもしれない前提で作り直すなどは私なら試します。酵素の反応時間を長くしたり短くしたりすることもこの検証に役立ちます。

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用
No.7755-15 - 2019/03/18 (月) 18:36:09 - アップルキッド
cDNAさんご意見ありがとうございます。

結果が出ず焦ってしまっていました。投稿を読み返すと分かり難いですね。
申し訳ございません。現状をまとめます。

(1)同じ条件(今回はN=2)の値はぶれるか
→今回の測定では同じ条件(N=2)間に数値の乱れはありませんでした。

(2)濃度既知のスタンダードの検量線は直線に乗るか、その濃度範囲はどれほどか
→いつもなら検量線の直線が各点に接する様な感じで引けますが、今回は低濃度側の1点が外れております。何回もやり直したのですが、同じ様なプロットしか得られませんでした。
誤解を与えてしまったみたいですが、ブレが解消したのはサンプルで、スタンダードはブレと云うかこの低濃度1点が直線に乗らないと云う問題が生じています。
STDの濃度はサンプルで生成される還元糖の濃度付近を範囲に4点で検量線を引いております。

(3)酵素活性は適切に測れているか
→前任の実験ノートの記載が間違っていないことを前提としますが、今回測定している酵素では基質の濃度、酵素の希釈率、酵素反応時間に関しまして検討の上で実験方法が確立されております。
今まで問題無く測定できていたのに、急に高濃度側が低く見積もられる様になったのか皆目見当がつかなく困っております。

(無題) 削除/引用
No.7755-14 - 2019/03/15 (金) 17:05:06 - cDNA
最初に戻って、問題点を切り分けてみた方がいいのではないでしょうか。

(1)同じ条件(今回はN=2)の値はぶれるか

(2)濃度既知のスタンダードの検量線は直線に乗るか、その濃度範囲はどれほどか

(3)酵素活性は適切に測れているか

(3)はあくまで(1)(2)に問題が無いことが前提じゃないと議論しても意味がありません。スタンダードのぶれが大きいということでは無かったでしょうか。今回はそれは解消したという意味でしょうか。

仮に(1)(2)の問題が解決済でしたら、酵素活性を測定するには適用出来る適切な濃度範囲はどうしても有限で、現状で既に広すぎれば酵素の高濃度で低く見積もられることはよくあります。または基質が酵素活性に影響を与えるほど低くなっていたり、生成物が阻害する場合には生成物濃度が上がり過ぎれば当然低く見積もられます。
酵素濃度を決めるのは、これらの問題が無い範囲を調べるためのもので、この条件検討には酵素反応時間も当然含まれます。

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用
No.7755-13 - 2019/03/15 (金) 12:49:18 - アップルキッド
cDNAさん、DMRさんご意見ありがとうございます。

昨日、Somogyi-Nelson法と同時にDNS法も行なってみました。
>精度が高く、酵素調整、活性測定のどこかを手抜きするとそれが如実にわかる測定法
とのことだったので、酵素希釈、酵素反応、呈色反応時に誤差が出ない様に注意して取り扱いました。
また、
>30分以上置いたら色が安定したりしませんかね?
のご意見もあったので、ネルソン試薬を加えてから30分間静置させました。
>加熱後、急冷してからネルソン試薬を加える
のご指摘ですが、前の投稿で実験操作をざっくりとしか書かなかったのですが、煮沸20分間させた後に氷上で冷却して室温程度に戻ったらネルソン試薬を加えています。
Somogyi-Nelson法の結果ですが、サンプル(酵素有・無)の2個間のバラつきは殆どありませんでした。
ただ相変わらず、酵素濃度が高い方のサンプルでは生成される還元糖が低く出ます。その為、線形近似曲線を引くと酵素添加濃度が低い方のプロットは線から飛び出して、酵素添加濃度が高い方のプロットは線より下に…という感じになりまして、相関係数は低いままでした。
最早これは私のテクニカル面が原因と考えるべきでしょうか…。

DNS法の結果ですが、酵素有・無の吸光度が殆ど変わりませんでした。この酵素では検出限度的に無理がある様です。


基質のカルボキシメチルセルロースですが、実験前に遠心は行なっておりません。瓶に入っているのを必要量ピペットで吸い上げて使っておりました。
そして、このご指摘で思い出したのですが、再現性が取れていた時期は研究室に置いてあったCMC(3年以上前に作製)を使用していたのですが、今現在実験に使っているのは最近私が作製したものでした。

(無題) 削除/引用
No.7755-12 - 2019/03/14 (木) 10:10:15 - DMR
ソモネル法は学生時代にさんざんやりました。
精度が高く、酵素調整、活性測定のどこかを手抜きするとそれが如実にわかる測定法でした。

DNS法の下りは、とりあえずそちらで同様の操作を実行し、ばらつきが出るようなら活性測定の方法(酵素調整、基質調整、反応系)に問題がある、そうでなければ試薬の問題(もちろん、発色操作に問題があるのかもしれないが)を切り分けるために提案しました。

そういえば思い出しました。ソモジネルソン法は基質(カルボキシメチルセルロースとか)によっては複合体が出来て沈殿が生じますが、測定前に遠心はしてますか?

(無題) 削除/引用
No.7755-11 - 2019/03/13 (水) 19:47:21 - cDNA
>また、本来はネルソン試薬を加えたら発色の安定を待つ為に30分程度置きますが、研究室の慣例的に待たずに測定しております(個人的に即測定するのはどうかと思うのと、準備に手間取るのでだいたい15分後ぐらいに測定しています)。

との事ですが、30分以上置いたら色が安定したりしませんかね?

また、加熱後、急冷してからネルソン試薬を加える、というプロトコールもあるので、急冷してみては如何でしょうか。

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用
No.7755-10 - 2019/03/13 (水) 19:04:44 - アップルキッド
DMRさん、おおさんご意見ありがとうございます。


酵素無し(代わりにbuffer)の吸光度及びSTD無し(代わりにMilliQ)の吸光度の件ですが、どちらも実験を行なう度にバラつきがあったり無かったりと安定しません。
2個ずつ作製(N=2)おりますが、この2個間で同じ様な数値が出ることもあれば、両者でかなり数値が異なることもあり、実験を繰り返す度に数値は変動します。
普通ならブランクは殆ど一定の数値になりますよね…
これは今回再現性が取れない以前にも見られた現象だったので、Somogyi-Nelson法自体が他の還元糖の定量法に比べて再現性が取れ難い(テクニカル誤差がシビアな)方法なのかと思っていたのですが、どうなのでしょうか?
もし、Somogyi-Nelson法をご経験されていたらご教示下さい。


>別の還元糖測定法を試されてはいかがでしょうか
酵素によってはDNS法やシステイン-カルバゾール-硫酸法を用いて還元糖の定量しております。
本実験の目的が、以前に活性測定した時(Somogyi-Nelson法)の値と今回の活性値がどう変化しているのか?と云うことなので、残念ながら他の方法では行なえません。
この酵素をどうして危険物を使うSomogyi-Nelson法で行なったのか、前責任者に小一時間問い詰めたい程です…。。

(無題) 削除/引用
No.7755-8 - 2019/03/13 (水) 00:43:45 - おお
ブランクはどうでしょう?

(無題) 削除/引用
No.7755-7 - 2019/03/12 (火) 22:16:24 - DMR
そうですか。

それでは、すぐやれるのであれば、別の還元糖測定法を試されてはいかがでしょうか。例えばDNS法とか。
その結果を比較すれば、酵素、あるいは測定系に問題があるのか、試薬の問題なのかが切り分けられるはずです。

ところで、酵素無しの基質ブランクの吸光度はいかがでしょうか?
案外、酵素反応の緩衝液にトラブルの原因があるのかも?
まぁ根拠はありませんが。

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用
No.7755-6 - 2019/03/12 (火) 17:48:29 - アップルキッド
DMRさんご意見ありがとうございます。

本日、同分光光度計、同波長で別の酵素の活性(Somogyi-Nelson法ではありません)を測定したところ、問題無く従来通りの結果を得ることができました。
分光光度計のランプが切れかかっていたのが原因だった…とかなら対処できるので嬉しかったのですが。。

(無題) 削除/引用
No.7755-5 - 2019/03/12 (火) 12:26:21 - DMR
過去分光光度計のプリズムを動かす部品が渋くなり、めちゃくちゃな値が出たことがあります。
同じ測定器を使っている人に、結果がおかしくないか確認してみては。

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用
No.7755-4 - 2019/03/12 (火) 09:47:31 - アップルキッド
totoさん、おおさん、投稿ありがとうございます。


>リン酸が邪魔する
このことは初めて知りました。勉強になります。
使用する器具は全てディスポです。
この指摘で、3ヶ月前(測定が問題無くできてた時)と今回では使用しているスクリューキャップ付きマイクロチューブのメーカーが違うことに気が付きました。ただ、メーカーは違いますがどちらも同じ様な形のディスポなので、直接の原因になりますでしょうか…?


>STDもばらつきますか?
実験ではSTD及びサンプルは2個ずつ作製しています(N=2)。元々、2個の間での数値のバラつきはあったのですが、今回はそのバラつきが大きくなっています。STDのバラつきも以前より大きいです。それ以上にサンプルのバラつきの方が酷いですが…
検量線を引くとSTDの低濃度側は接線から外れ易い傾向があります。傾き(a値)は過去の数値と比べると許容範囲ではありますが、相関係数(R2値)は低いです。

(無題) 削除/引用
No.7755-3 - 2019/03/12 (火) 01:16:38 - おお
STDもばらつきますか?

(無題) 削除/引用
No.7755-2 - 2019/03/11 (月) 23:07:39 - toto
この反応、たしかリン酸が邪魔すると思いましたが、試薬に接するものはすべて使い捨てのですか?昔は試験管の洗い方が悪いと、リン酸をたっぷり含む洗剤が残ってて、ばらつくという事がよくありました。スクリュウキャップに何かついてるとかないですよね。

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用
No.7755-1 - 2019/03/11 (月) 17:52:12 - アップルキッド
Somogyi-Nelson法を用いてある酵素の活性を測定していますが、ここ最近、実験の再現性が取れなくて困っております。


実験は以下の様な流れで行なっています。
@酵素を規定の濃度に希釈して基質と反応させる。
A酵素反応終了後、ソモギー銅液(和光から購入)を加えて20分間煮沸。
Bネルソン試薬(シグマから購入)を加え、比色分析。STDの検量線より還元糖の濃度計算。

今までと同様の手順で行なっているのですが、吸光度の数値のバラつきが大きかったり、酵素の添加濃度が異なる(生成される還元糖の濃度が異なる)のにも関わらず同じ様な吸光度の数値が出たりします。

ソモギー銅液とネルソン試薬ですが、以前から開封後3、4ヶ月経過すると数値の再現性に影響することが多々あったので、新品を購入して再度測定しましたがバラつきが収まることはありませんでした。


私のテクニカル的な問題(ピペッティング技術など)を抜きにして、何か原因が考えられますでしょうか?ソモギー銅液とネルソン試薬はすぐに劣化するものなのでしょうか?
この様な経験やアドバイスがありましたら、ご教示下さい。


ちなみにですが…

酵素反応の関係上、通常Somogyi-Nelson法で用いられるビー玉試験管では無く、スクリューキャップ付きマイクロチューブを使用しています。
煮沸前後で体積が大幅に変化している訳では無いので、煮沸中に水が入り込んだことが原因とは考えられません(それ以前にも同様の手法でやっており再現性が取れていたので…)。

また、本来はネルソン試薬を加えたら発色の安定を待つ為に30分程度置きますが、研究室の慣例的に待たずに測定しております(個人的に即測定するのはどうかと思うのと、準備に手間取るのでだいたい15分後ぐらいに測定しています)。

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