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プラスミドを高い濃度に抽出するようなコツがありますか? トピック削除
No.7772-TOPIC - 2019/03/15 (金) 17:02:54 - HEPES
こんにちは。

アルカリ方法でプラスミドを抽出してます。濃度はよくないけど…
最小に200ng/ulが必要ですが、濃度が少ないので困ります。(180や190が普通で、少ないのは110でした)

大腸菌は1.4Lの培地に培養し(ODは1.4以上)、50mlファルコンチューブに50mlずつ分けたものを遠心分離し、培地は捨てて菌だけを零下70度に保管して使います。

ミニスケール抽出(カラムは1.5mlのチューブ用)では高い濃度ですが、一度にほとんど500ulを使うのでそれでは不足です。普通はミディスケール抽出(カラムが50mlチューブ用であります)をしていますがこっちは濃度がよくありません。

アルカリ法で高い濃度のプラスミドを抽出できるか、チップがあれば教えてください。
 
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36件 ( 1 〜 20 )  前 |  1/ 1. 2. /2


(無題) 削除/引用
No.7772-36 - 2019/03/20 (水) 18:22:06 - み
何語を使用しても論理的に考えることができない人は相手にされません。
おそらくカラムは劣化していないだろうと思う。
おそらく菌を溶解する段階が問題ではないだろうと思う。
この掲示板を覗いている人の大半は、となりであなたの実験を見れば簡単に解決できる問題だと思います。
これまでの皆さんの意見を参考にすれば答えは出るはず。

(無題) 削除/引用
No.7772-35 - 2019/03/19 (火) 19:26:24 - あ
日本語が苦手なら英語使え

(無題) 削除/引用
No.7772-34 - 2019/03/19 (火) 13:00:54 - え?
集菌時のODが低すぎるせいで菌体量が少なすぎることが原因の一つでしょうね。

(無題) 削除/引用
No.7772-33 - 2019/03/19 (火) 12:27:58 - ちん○
やはり日本人ではなかったのですね。

まずは問題点を明確にすること。

(無題) 削除/引用
No.7772-32 - 2019/03/19 (火) 11:55:29 - おお
>[Re:31] Rさんは書きました :
> >細胞分解段階でよくして、
>
> lysis buf. (アルカリ-SDS) 入れる前に、よく懸濁することかなぁ。
> ペレットが塊のままだと溶けないから。

Lysozymeを使うという手もあるね。

加えて、エタチン以外の濃縮ほうほうでスピードバックって言う手があるにはあるけど。バッファー成分など共存するものも濃縮されるとか、正確に思った終濃度にあわすのが難しいなどの難点があります。出来るといえば出来るという程度。

(無題) 削除/引用
No.7772-31 - 2019/03/19 (火) 09:21:58 - R
>細胞分解段階でよくして、

lysis buf. (アルカリ-SDS) 入れる前に、よく懸濁することかなぁ。
ペレットが塊のままだと溶けないから。

(無題) 削除/引用
No.7772-30 - 2019/03/19 (火) 09:19:26 - R
エタ沈が一番手っ取り早いと思うけど。

エタ沈すらやったことがなかったり、
敷居が高く感じる人やラボが、
ありふれる時代になるのかもね。

周りを見渡すと、さもありなん。

(無題) 削除/引用
No.7772-29 - 2019/03/19 (火) 09:17:37 - HEPES

> 希にカラムが劣化していて結合容量が激減しているときがありますので、その可能性を排除したいのです。

一般的には1年前のカラムだけを使いますが、今度抽出に使ったのは2年前のものです。たぶん、劣化したカラムだったかもしれませんね。

(無題) 削除/引用
No.7772-28 - 2019/03/19 (火) 09:13:39 - HEPES

> 同僚で指導できる人はいないのでしょうか?

たずねてみても、同じ答えばかりです。
細胞分解段階でよくして、といいますが、どんなにするほうがいいかのことは教えてくれませんでした。

(無題) 削除/引用
No.7772-27 - 2019/03/19 (火) 09:09:01 - HEPES
お返答ありがとう。

私は日本人ではないので、日本語が不自由なほうがあります。
それに対しては誤ります。すみません。

(無題) 削除/引用
No.7772-26 - 2019/03/19 (火) 03:12:18 - おお
状況がわかりましたのでうまくいくかどうかわかりませんがアイデアとして、

キットがしめす標準プロトコールは600ulで溶出ということですが、何回かに分けて溶出するとより多く溶出できそうなイメージがあります。たとえば300ulで溶出して、さらにもう一度300ulで溶出する。

(無題) 削除/引用
No.7772-25 - 2019/03/19 (火) 00:17:27 - おお
キットの取り説をみると500ulで溶出して200ng/ulぐらいで収量が半分。収量を上げるにはもう少し大目の容量で溶出しなければならないみたいです。

なのでこのキットではあなたの考えているような濃度で溶出するのはちょっと難しいかもしれない。

>−大腸菌を培養するフラスコは2Lのもの、二つです。(700mlに分けて培養します)

2Lに700mlは多すぎますせめて1.4L なら5つぐらいのフラスコに分けるべきでしょう。これが理由で大腸菌があまり増えてない。なので収量が低く溶出したときの濃度が低くなる可能性はある。ただ、上に書いたようにキットの性質上200ng/ulが上限。

もっと高濃度で溶出できるキットがあるならばそれに換えるほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.7772-24 - 2019/03/18 (月) 23:22:29 - あ
みなさん本当に親切ですね

(無題) 削除/引用
No.7772-23 - 2019/03/18 (月) 22:13:14 - mom
日本語が下手でも良いですが、情報の小出しは困ります。最初から詳しく書きましょう。pUCは高コピーですが、インサートによってはコピー数が減る時もあります。
解決策として、「キットをイオン交換系カラムを使ったものに変える」のが早いと思いますが、今お使いのキットがもったいないですよね。
ではどこに問題があるでしょうか。それを探す能力を鍛えてください。
今お使いのキットで、他のプラスミドは予想通りの量が取れていますか?
希にカラムが劣化していて結合容量が激減しているときがありますので、その可能性を排除したいのです。
そのためには、アルカリSDSを行った後、少量(miniprepと同量)EtOH沈殿して電気泳動でplasmid量を調べてみてください。
もし劣化していて購入したばかりの新品なら業者にクレームを言えば交換してもらえると思います。

(無題) 削除/引用
No.7772-22 - 2019/03/18 (月) 18:15:23 - み
HEPESさん。。。質問の意味を理解されていませんね。
返答の的がズレテイル。
日本語が不自由な方でしょうか?
同僚で指導できる人はいないのでしょうか?
plasmid DNAを大量に使用する実験をされているラボですよね。

(無題) 削除/引用
No.7772-21 - 2019/03/18 (月) 18:09:41 - HEPES
−キットにあるカラムはシリカ系であります。

−大腸菌は1.4Lの培地でOD600が1.4になるときまで培養し、それを50mlチューブに盛り、遠心分離して培地を捨て零下70度で保管したものを使います。(実際に使う量は50mlと見てもいいです)

−大腸菌を培養するフラスコは2Lのもの、二つです。(700mlに分けて培養します)

−エタチンが何かはよく分かっていますが、ラボではそれを使いません。もしプラスミドの濃度が少なくて、それが必要なほどだからしてみるつもりです。

−プラスミドはpUC18で、高コピーであります。

(無題) 削除/引用
No.7772-20 - 2019/03/18 (月) 18:02:43 - HEPES
>[Re:18] みさんは書きました :
> >[Re:17] mozさんは書きました :
> > mini-prepで十分な(説明書記載に近い)量が取れているようですので、コピー数が少ないわけではなさそうですね。
>
>
> 1.4L cultureの一部をmini-prepしたかどうかは不明。
> 僕の予想ではmini-prepとLarge scale cultureの培養はindependent
1)プラスミドはpUC18で、高コピーであります。
2)1.4Lのカルチャーの意味は:
 1.大腸菌(pUC18を持っている)をLB培地1.4Lにカルチャーします
 2.18時間ぐらいあとに、OD600が1.4以上になればそれを50mlと15mlチューブに盛ります(チューブを満たすほど)
 3.遠心分離して培地を捨て、零下70度に保管します
ということです。実際、実験に使う金はmidiで50mlであります。

>[Re:17] mozさんは書きました :
> > Geneall Exprep mini/midiを使っています。
> キットの説明書に書かれている対策(溶出液を温める等)は試してみましたか?
はい。そこに書いているものは全部して見ました。

(無題) 削除/引用
No.7772-19 - 2019/03/18 (月) 15:40:48 - 質問
何人もの方があなたの実験の問題点を探ろうと質問をしていますよ。それらには答えないでスルーですか?

(無題) 削除/引用
No.7772-18 - 2019/03/18 (月) 15:17:39 - み
>[Re:17] mozさんは書きました :
> mini-prepで十分な(説明書記載に近い)量が取れているようですので、コピー数が少ないわけではなさそうですね。


1.4L cultureの一部をmini-prepしたかどうかは不明。
僕の予想ではmini-prepとLarge scale cultureの培養はindependent

(無題) 削除/引用
No.7772-17 - 2019/03/18 (月) 14:07:54 - moz
> Geneall Exprep mini/midiを使っています。
キットの説明書に書かれている対策(溶出液を温める等)は試してみましたか?
mini-prepで十分な(説明書記載に近い)量が取れているようですので、コピー数が少ないわけではなさそうですね。
収量が少ない原因として考えられるのは、
カラムあたりの使用菌体量が足りない、菌体沈殿に培地成分の混入が多い(カラムへの結合を阻害する)、溶菌過程が不十分(溶液色が変わるようなので考えづらい)、溶出しづらいplasmidなのかな? と思います。

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