BioTechnicalフォーラム [プラスミドを高い濃度に抽出するようなコツがありますか?]

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(無題)

No.7772-18 - 2019/03/18 (月) 15:17:39 - み

>[Re:17] mozさんは書きました :
> mini-prepで十分な(説明書記載に近い）量が取れているようですので、コピー数が少ないわけではなさそうですね。

1.4L cultureの一部をmini-prepしたかどうかは不明。
僕の予想ではmini-prepとLarge scale cultureの培養はindependent

(無題)

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No.7772-17 - 2019/03/18 (月) 14:07:54 - moz

> Geneall Exprep mini/midiを使っています。
キットの説明書に書かれている対策(溶出液を温める等）は試してみましたか？
mini-prepで十分な(説明書記載に近い）量が取れているようですので、コピー数が少ないわけではなさそうですね。
収量が少ない原因として考えられるのは、
カラムあたりの使用菌体量が足りない、菌体沈殿に培地成分の混入が多い（カラムへの結合を阻害する）、溶菌過程が不十分（溶液色が変わるようなので考えづらい）、溶出しづらいplasmidなのかな？　と思います。

(無題)

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No.7772-16 - 2019/03/18 (月) 09:53:19 - HEPES

>[Re:7] おおさんは書きました :
> カラムとか書いてるけど何処のキット（商品）を使っているのですか？

Geneall Exprep mini/midiを使っています。

+濃度が使うことできないほど少ないから、エタチンも考えて見ます。
それが何かとどうするのかは分かっていますが、私のラボではよく使っていません。

(無題)

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No.7772-15 - 2019/03/18 (月) 09:50:42 - HEPES

>[Re:10] HEPESさんは書きました :
> みなさん気づいてないと思いますが、
> 私はトリスと同じです。
> 今度はヘペスになりました。

おや、あなたは誰で私を真似ていますか?

(無題)

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No.7772-14 - 2019/03/18 (月) 09:48:53 - HEPES

>[Re:13] momさんは書きました :
> Midiキットはシリカ系カラムですか、イオン交換系カラムですか？

シリカ系です。

(無題)

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No.7772-13 - 2019/03/16 (土) 13:26:14 - mom

Midiキットはシリカ系カラムですか、イオン交換系カラムですか？
シリカ系カラムなら最終溶出液（低塩濃度）がそのまま遺伝子導入に使えますし、イオン交換系カラムならイソプロピルアルコールを添加して遠心し沈殿をTE等に溶解しますので判断は容易です。お話からはシリカ系カラムのようですが。
イオン交換系カラムなら自作のアルカリSDS溶液でマニュアルより多めの菌体を溶菌しオーバーロード気味にカラムにかければカラムのカタログ結合量以上のplasmidを精製出来ます。
シリカ系カラムでも、自作のアルカリSDS溶液＋カラム結合用溶液を使えばカラムのカタログ結合量に近い量が取れます（経験的にオーバーしたことはありません）。また、溶出液はDDWより10mM Tris(pH8.5)の方が溶出量が上がります。
/www.u-tokai.ac.jp/academics/undergraduate/engineering/kiyou/pdf/vol_57_001/03.pdf
なお、最終溶出液エンドトキシンを減らすor Freeにするには、注意（一工夫？）が必要です。

(無題)

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No.7772-12 - 2019/03/16 (土) 03:12:35 - おお

わたしもOD値が低いので大腸菌がエアレーションが悪いために増えきってないのではと思い始めています。

三角フラスコの容量の十分の１程度が目安で、２リットルのフラスコなら２００ｍｌの培地（私のところは３００ｍｌ）以上入れないようにしてエアレーションが悪くならないようにすると書いているものを見かけます。

(無題)

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No.7772-11 - 2019/03/15 (金) 23:25:34 - うん

>[Re:10] HEPESさんは書きました :
> みなさん気づいてないと思いますが、
> 私はトリスと同じです。
> 今度はヘペスになりました。

変な日本語でレベルの低い質問をして無礼な対応をしているひとですか

それで何が問題なのか理解できたのかい？

普通にやっていれば何も問題が起こらない実験をされているとお見受けしますが。

(無題)

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No.7772-10 - 2019/03/15 (金) 21:55:13 - HEPES

みなさん気づいてないと思いますが、
私はトリスと同じです。
今度はヘペスになりました。

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No.7772-9 - 2019/03/15 (金) 21:52:07 - え？

ODが1.4って、もっともっと増えるでしょ？

(無題)

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No.7772-8 - 2019/03/15 (金) 21:21:11 - おお

あと精製しようとしているプラスミドのOriのタイプも気になります。

(無題)

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No.7772-7 - 2019/03/15 (金) 21:18:17 - おお

カラムとか書いてるけど何処のキット（商品）を使っているのですか？

(無題)

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No.7772-6 - 2019/03/15 (金) 18:12:52 - み

あなたの言っている溶解液のvolumeは菌体を最初に溶解するときのvolumeだろうな。違うんだなあ。
おおさんが言うように最終的に溶出(精製）した液をエタ沈し直して少量のTEに溶かしなおしたら幾らでも高濃度のものは調製できるだろうということ。

1.4Lの培地を何リットル入る容器で培養しているの？
airationが悪くてLarge prepでは収量が低いのかな？
コピー数によるけどHigh copyなら５０ｍｌの菌液からでもmidi columnで250ugくらいは取れる。あなたの言う200ng/ulにするなら1250ul採れていることになる。

200mlの菌液くらいなら市販のlarge prep columnで1mgくらい採れる

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No.7772-5 - 2019/03/15 (金) 18:12:27 - AP

EtOH pptでバッファー交換や濃縮、分子遺伝学実験の基本中の基本操作です。

そもそも培養液あたりのプラスミド収量はどれくらいなの？
それが著しく低いわけ？　それとも収量はまともだけれど、カラムシステムの仕様で溶出体積が大きすぎて濃度が低くなりすぎるということを言いたいわけ？

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No.7772-4 - 2019/03/15 (金) 17:55:57 - おお

意味が分かりませんが、最終的に得られた溶液をエタチンすればいいと申しあげているので、その時点ではカラムは関係ないはず。それとも収量が悪いのが原因で起こっているのですか？

(無題)

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No.7772-3 - 2019/03/15 (金) 17:44:03 - HEPES

>[Re:2] おおさんは書きました :
> 一度エタチンしてより少量の水かTEで溶解すれば言いだけの話じゃないの？

プラスミドを多く使うので、そんなにすれば抽出に時間が多くかかります。そしてカラムには最小に入れなければならない体積があり、その以下では溶解しても効率が下がります。

その範囲はミニスケールでは50-200ulであり、ミディスケールでは600ulです。

(無題)

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No.7772-2 - 2019/03/15 (金) 17:17:35 - おお

一度エタチンしてより少量の水かTEで溶解すれば言いだけの話じゃないの？

プラスミドを高い濃度に抽出するようなコツがありますか?

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No.7772-1 - 2019/03/15 (金) 17:02:54 - HEPES

こんにちは。

アルカリ方法でプラスミドを抽出してます。濃度はよくないけど…
最小に200ng/ulが必要ですが、濃度が少ないので困ります。(180や190が普通で、少ないのは110でした)

大腸菌は1.4Lの培地に培養し(ODは1.4以上)、50mlファルコンチューブに50mlずつ分けたものを遠心分離し、培地は捨てて菌だけを零下70度に保管して使います。

ミニスケール抽出(カラムは1.5mlのチューブ用)では高い濃度ですが、一度にほとんど500ulを使うのでそれでは不足です。普通はミディスケール抽出(カラムが50mlチューブ用であります)をしていますがこっちは濃度がよくありません。

アルカリ法で高い濃度のプラスミドを抽出できるか、チップがあれば教えてください。

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