BioTechnicalフォーラム [pETプラスミドを用いたタンパク質発現の条件検討]

pETプラスミドを用いたタンパク質発現の条件検討

No.10335-TOPIC - 2022/03/13 (日) 14:35:45 - 地方学生

いつも大変お世話になっております、地方大学で研究を行っているもの(学生)です。
最近、pETプラスミドを用いたタンパク質発現を試みているのですが、発現条件(発現誘導時間、IPTG濃度など)を変更して、高収量での発現を目指したいのですが、みなさんはどのように条件を割り振っていますか。また、その際の具体的な方法についてもご教授いただけますと幸いです。
　

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No.10335-3 - 2022/03/15 (火) 01:22:13 - おお

大腸菌で発現させて少ないときも、そのコンストラクトではそんなもんだと思ってあまり培養条件など検討する事は個人的にはないです。多少なりともというならアイデアとしてはなくはないですが、、、

Tagの入れ方などで劇的に変わるかどうかもわかりませんしそれに関しても確実なアプローチがあるとはあまり聞きません。コドンの最適化なんかも考えられる方法論ですが、それで変わる保証もありません。

なので必要ならスケールアップする程度です。ただ結晶をつくって構造を見たりするのであれば大量にタンパクがいるだろうと思うのでそういうラボでどうしているかは興味があります。

収量が増やせそうなのは無細胞系にするなど系を変えてみることもあり得る選択だと思います。

まあそれでもいい機会と考えて検索して実際どんな工夫があるのか調べたりしてみてもいいのかもしれません。
簡単に検索してつまみ食いしてみると、
PMID: 17565681
PMID: 12661158
https://cdn.technologynetworks.com/TN/Resources/PDF/biosilta_Poster0512.pdf
PMID: 17020876

個人的に思うのはアンピシリンは分解されていって濃度が下がり、大腸菌内のプラスミドが培養するに連れて下がっていたりする可能性を排除するために、Inductionする前に遠心で大腸菌を回収してアンピシリンやCarbenicillin（こちらのほうがアンピシリンより安定している）を含む誘導培地に懸濁するとか。まあでも良くて２倍程度かもしれない。

(無題)

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No.10335-2 - 2022/03/13 (日) 18:36:26 - G25

発現量や収量はコンストラクトごとに決まってしまっていて、誘導の条件によって収量が著しく向上するということもないというのが実感です。発現量があまりにしょぼいときは別のデザインでコンストラクトを作り直します。

条件検討に手間をかけるのは、労多くして功少ない結果になりかねない。スタンダードな条件で得られる収量がその系の仕様だと考えて、必要量は培養スケールを調整して達成したらいいでしょう。

誘導の条件のコントロールが効いてくるのは、可用性画分にいくのと、封入体として不溶性画分にいくのとの配分でしょう。
封入体化しない融合タンパク質であったり、不溶性で発現しても構わない場合なら、スタンダードな推奨条件だけでも十分。
可溶性がほしいけど、封入体を形成してしまう場合は、封入体化を抑えることで、可溶性の収量があげられる可能性はあります。

宿主ベクター系によって有効なパラメータは違うので、一概には言えないと思いますけど、
IPTG誘導ならIPTG濃度をふる(例えば通常 1 mMのところ0.1 mMくらいまで下げるとか）。
培養温度を下げる（30, 25, 18℃など）
とか。

まあ、これも一度、スタンダードな方法でパイロットテストをしてみて、封入体形成の問題が確認されてから考えればいいと思います。

pETプラスミドを用いたタンパク質発現の条件検討

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No.10335-1 - 2022/03/13 (日) 14:35:45 - 地方学生

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