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(無題) 削除/引用 No.10504-8 - 2022/06/02 (木) 13:35:51 - S.O. PFさん： ご回答ありがとうございます。 細胞の凝集は目で見てわかり、おっしゃる通り、特に固定・透過処理後により顕著に現れます。 HBSSはCa/Mg入っているものを使用しており、HBSS（コラゲナーゼ・DNase）存在下で同様に保存していた細胞は凝集が見られないので、DNaseはしっかりワークしていると思われます。ただ、染色のステップを重ねるにつれ凝集が多くなり、最終的にフローサイトメトリーで解析できるまでの量が少なくなってしまいます。 また、別の問題になってしまいますが、私もFoxp3を染色していますが、細胞の凝集のせいなのか染色効率が悪くあまり強度が得られておりません。 固定後の遠心は300g 10 minで行っておりました。400gに上げて試みてみます、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10504-7 - 2022/06/02 (木) 13:30:34 - S.O. あの さん： ご回答ありがとうございます。 操作自体は静置して行っています。攪拌しながらが可能であれば行ってみたいと思います、ありがとうございます。 セルストレーナー前後ではねっとりしている感じはないのですが、染色のステップを進めていくにつれてねっとりしたような細胞の塊が出てきます。 記載忘れておりすみません、ブロッキングは表面抗原染色の前に行っています。

(無題) 削除/引用 No.10504-6 - 2022/06/02 (木) 11:27:30 - PF 細胞内染色後に起きた凝集は、どう確認されましたか？　最後の洗浄の過程で凝集塊が肉眼で見えたのか、肉眼では見えないけどFACSでシングルセルが減っている事を確認したのか、あるいは、単に解析細胞数の低下からどこかの過程で凝集したと推測してるのでしょうか？ 個人的な経験では、凝集するなら固定直後から起きてることが多い印象です。肺や腸からの細胞回収では、酵素処理後から凝集が見られる事もありますが、DNaseがへたってると凝集しやすいかもしれません。EDTAで止めてるという事は、HBSSにCa/Mgが入ってると思いますが、念のため確認されると良いかと思います。入ってないとDNaseの効きが悪くて凝集の原因になるかもしれません。 ちなみに私の場合、脾臓からの細胞回収では酵素は使わずセルストレーナー上ですり潰してました。この方法で回収した脾臓細胞で細胞表面T細胞マーカーを染色後、FoxP3の細胞内染色をやってましたが、凝集が大きな問題になった事はありません。私が使っていたキット(eBioscienceだったと思いますが、昔の事なので不確かです）では、固定後の遠心は400gで長め(8-10分だったと思います)に回してました。BDは使ったことがないですが、遠心のプロトコルも確認された方が良いかも。遠心が不十分だと細胞ロスの原因になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10504-5 - 2022/06/02 (木) 05:30:05 - あの あまり扱ったことのないターゲットなので的外れかもしれませんが、、、 もし次のステップで静置しているなら、何らかの方法で、軽く攪拌し続けてみたら どうでしょう？　 　　表面抗原染色から細胞内染色 それからセルストレーナーを通過させる前後で、サンプルが、ねっとりしすぎている ようなことはありませんか？　もしそうなら、何らかの洗いが必要そう。 ところで、ブロッキングのステップが無いようだけど、大丈夫なのですか？

(無題) 削除/引用 No.10504-4 - 2022/05/31 (火) 17:48:19 - S.O. 屠殺とはどういうことでしょうか。 質問の意図が読めず恐縮です。 なお、マウスは脱血で殺したのち、脾臓を取り出して細胞の回収を行っております。

(無題) 削除/引用 No.10504-2 - 2022/05/31 (火) 16:46:52 - a 屠殺方法はいかがですか？

脾臓細胞の回収 削除/引用 No.10504-1 - 2022/05/30 (月) 15:19:35 - S.O. T細胞のフローサイトメトリー解析のために、マウス脾臓細胞を回収し表面抗原及び細胞内抗原を染色しています。 細胞回収は問題ないのですが、その後、特に固定透過処理を行い細胞内抗原の染色を行った後あたりから細胞が凝集し、最終的に解析できる細胞数が減ってしまうことに悩んでいます。 固定透過処理により細胞が死んでしまうことによるものでしょうか。 また、細胞染色過程での凝集を防ぐ方法や、下記に示した条件に誤りがあればご教授お願い致します。 細胞回収条件と染色条件は以下の通りです（洗浄の過程は省略して記載） 細断した脾臓をHBSS 5mL（コラゲナーゼ500ug/mL, DNase 150ug/mL）で37℃30分インキュベート ➡EDTA2mMとなるように添加し反応を止める。 ➡セルストレーナー（70um）に通す。 ➡ACK lysing bufferで溶血処理 ➡細胞3E+06に対し表面抗原抗体を添加し染色（30min on ice） ➡固定・透過処理　（BDのTranscription Factor Buffer Setを使用・ 45min on ice） ➡細胞内染色　（45min on ice） ➡解析へ なお、洗浄や抗体希釈用のbufferはBDのFetal Bovine Serum Stain BufferおよびPerm/Wash befferを使用しています。

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