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(無題) 削除/引用 No.1067-7 - 2012/10/29 (月) 15:05:05 - おお Brijって弱いイメージがありましたが、カヨウ化しにくいものにもつかうのですね。しゅるいによるのかな。べんきょうになりました。

(無題) 削除/引用 No.1067-6 - 2012/10/29 (月) 14:54:13 - in situ すいません。IPに使うと書いてありましたね。 申し訳ありません。 以前、可溶化しにくい膜たんぱく質を可溶化してIPするのにBrijシリーズを使っていた人はいました。

(無題) 削除/引用 No.1067-5 - 2012/10/29 (月) 14:48:51 - in situ そのあと何をやるかにもよりますが、ウエスタンしかしないならば直接SDSサンプルバッファーに溶かしてしまうというのも一手だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1067-4 - 2012/10/29 (月) 14:39:31 - おお 一般的によく使われているRIPA bufferは 1% NP-40 or Triton X-100 0.5% deoxychorate 0.1% SDS が含まれてますけど(濃度など若干違う場合がありますけど)、、、 それを改変して強力にしたということでしょうか、、、 0.5% deoxychorateのかわりりchapsを加える改変レシピは見たことがあります。 それ以外につかえそうなもので膜をようかいできるものだと CHAPS CHAPSO BIGCHAPとかでしょうか、、、 そのほかMEGAー8、9、10とかいろいろあるにはありますけど、、あまりポピュラーでないですし、、、抗体がきくかどうかもやってみないとわからないでしょうし、、、RIPA(TRITONなどをふくむ)でも可也強力である種の抗体はIPでは使えなかったりします。 よわいでタージェンとはまだいっぱい選択肢がありますけどね。 若干量の2ーME/DTTとかEDTA/EGTAを加えると改善するものもありますが、、、 わたしはその手の実験はしてないので経験者の意見が聞けると良いですね。

(無題) 削除/引用 No.1067-3 - 2012/10/29 (月) 13:48:49 - aileron >おおさん 返信、ありがとうございます。 一般的なdetergentのTritonX-100やNP-40は入っていません。 普通のlysis bufferには入っていますが、この場合、膜画分をできるだけ溶かしたいので、より強力なRIPA bufferを使っています。 目的のものがraftにあるのかどうかわかりません。 ただできるだけ、均一に溶かしたいので書きました。

(無題) 削除/引用 No.1067-2 - 2012/10/29 (月) 11:58:07 - おお >[Re:1] aileronさんは書きました : > 問題は、その取ってきた画分を溶解するbufferです。 > > 普段は、RIPA buffer (50mM Tris(pH=8.0), 0.1% SDS, 0.5%デオキシコール酸, 150mM NaCl)で溶かしていいるのですが、どうも全部溶けきれてない気がします（ピペッティングをしていると、何か小さい塊が残っているような気がします） 見たいものが溶解していればペレットが残っていてもいいのでは。 >RIPA buffer (50mM Tris(pH=8.0), 0.1% SDS, 0.5%デオキシコール酸, 150mM NaCl) このバッファーにTRITON X-100かNP-40は入ってないのでしょうか。 > > ＣＨＡＰＳとかはどうでしょうか？ > lipid raftを壊すdetergentだと聞いたのですが・・・ raftにあるならraftを取ってきた方がよろしくないでしょうか。

microsome画分を溶かすbufferについて 削除/引用 No.1067-1 - 2012/10/29 (月) 11:43:29 - aileron 今、細胞をsucroseのbufferでhomogenizeして、それを超高速遠心でmicrosome画分を取ってきています。 問題は、その取ってきた画分を溶解するbufferです。 普段は、RIPA buffer (50mM Tris(pH=8.0), 0.1% SDS, 0.5%デオキシコール酸, 150mM NaCl)で溶かしていいるのですが、どうも全部溶けきれてない気がします（ピペッティングをしていると、何か小さい塊が残っているような気がします） ほかに、膜画分をよく溶かすbufferなり、detergentがあれば、よろしければ教えてください。（溶かした画分は、そのあとＩＰに使おうと思っているので、あまり強いdetergentも考え物で難しいところです） ＣＨＡＰＳとかはどうでしょうか？ lipid raftを壊すdetergentだと聞いたのですが・・・

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