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(無題) 削除/引用 No.11001-15 - 2022/12/09 (金) 15:51:40 - G25 溶液中のアクリルアミドモノマーは経時劣化し、ひどくなると重合不良、不均質な重合を起こしたります。ストック溶液の保存状態は良好ですか？ アクリルアミド溶液に酸素が多く溶け込んで重合を阻害しているかもしれません。アクリルアミド溶液を脱気してからゲル作成を使う流儀もあります。 酸素に触れると重合しないので、コームでしっかり密閉されていないとゲル上端の重合が不良になります。経験的に、コームになにか不純物が付着していてもコームに接触するゾーンで重合が不良になるようです（コームを新品にしたら解決したこともあった）。 >aps溶液をボルテックスせずに使っていたこと、 APSは溶液の状態でストックしているのでしょうか？ APS溶液の寿命は長くありません。重合にはAPSが重要で、APSがヘタるととたんに重合不良を起こします。粉から要時調製する、あるいは小分けしてフリーザーで保存、使用直前に解凍して、あまりは捨ててしまうなどの流儀があります。 また、本当にウェルの底からサンプルが漏れている（固まっていないアクリルアミドに拡散している？）のでしょうか。ゲルとガラス板の間に隙間ができていて、そこに漏れ出していたりしませんか？　 コームとスペーサーの厚みのフィット性とかゲルを流し込んでから固まるのを待つ間の保持のしかたの加減とかで、隙間ができちゃいないだろうか。

(無題) 削除/引用 No.11001-14 - 2022/12/09 (金) 15:45:08 - 5 Native PAGEでstackingは普通にあると思うけど。なくてもできないわけではないけど。

(無題) 削除/引用 No.11001-13 - 2022/12/09 (金) 15:14:26 - G25 native pageと言っているから、stacking gelは無しですよね？　 有るの？

(無題) 削除/引用 No.11001-11 - 2022/12/09 (金) 10:24:34 - toto 単にupper gelを作ってからの時間が短すぎるとか？重合が不完全ということですよね。

(無題) 削除/引用 No.11001-10 - 2022/12/09 (金) 09:52:49 - おお >[Re:6] あさんは書きました : > ゲルはしっかりと固まっているのに、重合が上手くできていないことはあり得るのでしょうか？ ゲルはしっかりと固まっている=重合している。 だと普通は考えます。よくわからないけどWell付近のアクリルアミドの濃度を少しだけ濃くしてみてはどうでしょうか、０.２％ほど高くするとか。 わたしはどうしてもゲル板を疑うのだけど、きれいに洗ってもうまく行かないことがあるなら、ゲル板をきれいに洗ってからシリコナイズしてもいいかも。ゲル板に傷とか入ってない？

(無題) 削除/引用 No.11001-9 - 2022/12/09 (金) 09:44:42 - zam ×　要事調製 ○　用時調製 失礼。

(無題) 削除/引用 No.11001-8 - 2022/12/09 (金) 09:43:41 - zam ぱっと読んで、APS溶液かTEMEDが古いか、蒸留水の重層当たりかなと思いました。違っていたらご容赦ください。 チェック項目として。 APS溶液の賞味期限（私は常に要事調製ですが、せいぜい一週間です）。 分離ゲル重合時の蒸留水の重層。 分離ゲル重合後の蒸留水の除去。 あとは。 APSの買い換え。 TEMEDの買い換え。 アクリルアミド溶液の新調。 さらに。 古いアクリルアミド・ビス溶液を使って低濃度ゲルを作ろうとすると、プロトコール通りのAPSやTEMEDでは重合しづらいです。ですので既にコメントにある通り、プロトコールよりも増量するとよいです。 ご武運を。

(無題) 削除/引用 No.11001-7 - 2022/12/08 (木) 21:16:04 - 5 探求すれば原因がわかるかもしれないけど、ここであまり時間を使うのは研究全体から見て得策でないと思うので、Native PAGEのゲル売ってるので買った方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.11001-6 - 2022/12/08 (木) 21:03:16 - あ ゲルはしっかりと固まっているのに、重合が上手くできていないことはあり得るのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11001-5 - 2022/12/08 (木) 15:24:40 - あ コメントをいただき、ありがとうございます。お返事が遅れてしまい申し訳ありません。本日、非変性pageを2回行いました。ご指摘いただいた通り、ゲル板およびコームをアルコールで念入りに拭いてから使用し、暖かい部屋で行いました。APSの濃度もプロトコル通りです。 その結果、1回目は上手くいったのですが、全く同じように実験したのにもかかわらず2回目は失敗してしまいました。ウェルに試料をアプライし、泳動を始めると試料が枝のように下に漏れ出て広がってしまい、結果としてバンドが大きくゆがんでしまいます。やはり重合がうまくいっていない？ムラがある？ように思います。

(無題) 削除/引用 No.11001-4 - 2022/12/02 (金) 03:45:55 - おお >[Re:2] おおさんは書きました : > Wellより下に流れ出ていくということでしょうか？ > それならゲル板があまりきれいでなくゲル板付近のアクリルアミドの重合が進んでないとかが原因かと思われます。 > これについて少し詳しく述べておきます。 SDSPAGEでの経験ですが、一時期サンプルをアプライして泳動を始めるとWellのそこから漏れ出て（泳動で移動する速度よりはやく）スタッキングとリゾルビングゲルの間に到達してその流れでBPBの色素が縦にできた筋のようになってしまったことがあります。さらにスタッキングとリゾルビングゲルの間に到達したあとその境界で左右に広がり結局はそのままWBするとサンプルのないレーンでもシグナルがみられ、レーンの間にもシグナルがありレーンをまたいで１直線になったようなよわいシグナルが検出されます。 原因が分からず結構悩みましたが、結局ゲル板をラボ用洗剤につけ指で丹念に擦って（スポンジなどは傷がつくだろうから、ただキムワイプならマシかも）、水を弾かないかどうか確認して(シリコナイズされたものなら弾いたままだけど)からゲルを立てるようになりました。油成分ならアルコールをかけてもいいかもしれません。それでそういう現象もなくなりました。

(無題) 削除/引用 No.11001-3 - 2022/12/01 (木) 21:37:25 - 5 いまいちイメージがつかめないのですが、レーンの底とはゲルの下端？　それともレーンでなくてwellの底？ もしそうだとしたら、要するに隣のwellの方に漏れて広がっていくということ？コームで作ったwellは割と軟弱なので、無理なことするとwell間の壁が壊れてすぐ切れたりするのでそこから漏れることはたまにあります。特にゲルの重合があまり時間がかかりすぎると緩いゲルができて壊れやすかったりします。普通ならば10~20分くらいで固まると思うので、それ以上かかるようならば、APSを液量で今の1.5倍量くらい入れて、なるべく暖かい部屋で重合させてみると早く固まります（寒いと固まりにくくなります）。TEMEDは強アルカリなのでpHが変わるとあれなので増量しないほうがいいです。 こうした問題は　native PAGEだからとかいうことでなく普通のSDS-PAGEでも同じことが起きます。 あとアクリルアミド-ビス混合液は少しずつ濃度の異なるものが何種類か市販されているのですが、参照しているプロトコルの指定のものと、今使ってものは濃度とかあってますか？これ間違えてると固まりにくかったりゲルが少し変になると思いますが大丈夫ですか。

(無題) 削除/引用 No.11001-2 - 2022/12/01 (木) 03:21:41 - おお Wellより下に流れ出ていくということでしょうか？ それならゲル板があまりきれいでなくゲル板付近のアクリルアミドの重合が進んでないとかが原因かと思われます。

native pageのトラブルについて 削除/引用 No.11001-1 - 2022/12/01 (木) 02:00:45 - あ native pageにおいて、ゲルのレーンに試料をアプライすると、レーンの底から試料が漏れ出てしまうということが続いています。 恐らく、ゲルの重合が上手く出来ていないことが考えられるため、apsとtemedを入れる工程に問題があるのだと思いますが、添加後に20回ずつ転倒混和を行っているため、混ざりきっていないことは考えにくいです。 心当たりとしては、aps溶液をボルテックスせずに使っていたこと、またゲル版にゲル液を流し込んだあと、コームを何回か挿し直してしまったことが考えられるのですが… 他に考えられる原因はありますでしょうか。教えていただきたいです。

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