皆様へ。
いろいろと情報ありがとうございます。
目的をもう少し詳しく書かせて頂きます。
研究のゴールとしてはiPS細胞から目的の細胞を分化誘導することです。その目的の細胞のマーカーが現時点で存在しないために試行錯誤している状態です。
特定の遺伝子というのは発生段階におけるある特定のリニエージのマーカー遺伝子です。今回GFPをその下流に2AでつなげようとしたのはiPSからまずはそのマーカーを発現するリニエージにさせて、FACSでソーティングして、さらに誘導をかけて目的の細胞にするということを考えているからです。特定の遺伝子が転写因子であるため、このような方法でしかソーティングが難しいと思われます。
ご指摘のあった件で、蛍光タンパクが2倍や3倍程度ではあまり効果がないという件、確かにうなづける話です。その辺はログで効いてくる部分ですからね。
Venusについては確かに明るい蛍光タンパクなのですが、うちの持っているAriaでは使えないらしいので、候補から外していました。
あと2Aで切れない(スキップされない)件ですが、確かに融合タンパクがなんかよからぬfunctionをgainする可能性は気持ち悪いですね。うーんって感じです。
あとNeo耐性遺伝子をプロモーター、CDS、ポリAシグナルのカセットでいれるのと、2Aでつなぐのと、IRESでつなぐのと、どれが一番良いのか、迷いますね。経験がないので・・・。 |
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