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(無題) 削除/引用 No.4761-18 - 2016/01/24 (日) 09:30:15 - おお ２６０と２７０ってちょっと波長が近いので先がぎざぎざになっているような感じでしょうか、、、それなら振り切れているか、少なすぎるかってこともあるかもしれません。２６０のピークがメインで２７０あたりに膨らみがあるような、肩があるような感じなら、２８０とのOD比があまり変でなければ気にする必要はないと私も思います。そういう波形はよく私も見ます。

(無題) 削除/引用 No.4761-17 - 2016/01/24 (日) 09:20:51 - ano 当方も、 気にせず先に進んだほうがいいと 思います。

(無題) 削除/引用 No.4761-16 - 2016/01/24 (日) 07:19:09 - おお まさかとは思いますが、Nano Dropのサンプルに触れる部分を一度アルコールでふいて状況が変わりますか? それかほかのラボのNano Dropで試してみるとか。

(無題) 削除/引用 No.4761-15 - 2016/01/24 (日) 07:13:24 - おお >[Re:10] Sさんは書きました : > 有難うございます。 > キットのライセートがQIAzolというのですが、恐らく成分にフェノールが入っています。 > プロトコール中にはクロロホルムとエタ沈の過程も入っていますのですが、うまく除けていないようです。 フェノールは一般的な分子生物学的な方法論として、クロロフォルム、エタチンで抜くというやり方が確立しています。抜けないなら違うものを疑った方がいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4761-14 - 2016/01/22 (金) 12:33:24 - AP 270 nmに肩ができる理由はなんであれ、気にせず先に進んだほうがいいと思う。 核酸の吸光度による定量は、260と280場合によってはそれに230を加えた二点、あるいは三点のみの測定しかしないのが普通で、他の波長は見ないし測らないけ。でも、それで十分ワークするものさ。

お返事有難うございます。 削除/引用 No.4761-13 - 2016/01/22 (金) 11:58:16 - S ありがとうございます。 260nmのピークがブロードにというよりは、 260にも270にも山が出来て、山が連なったような波形なのです。 フェノール以外のコンタミも疑ってみます。 260のピークがブロードに出ているだけならそのままcDNAにしてしまっても良いものでしょうか？ 皆様のアドバイスを参考に再検してみます。 本当にありがとうございます。 >[Re:8] seventhさんは書きました : > Lipidのキットはフェノクロの上層をカラム精製に使うようですよ。 > 通常のフェノクロでもフェノール由来のピークが出ることはまずないと思いますが。 > 270nm付近の吸光というのが明確なピークなのか260nmのピークがブロードになっているのかでまず何を疑うかも変わって来くると思います。

お返事有難うございます。 削除/引用 No.4761-12 - 2016/01/22 (金) 11:53:52 - S リンクの情報をありがとうございます。 しっかり拝見させて頂きます。 >[Re:7] APさんは書きました : > phenolは210付近と270付近にピークがあるようですね。 > http://www.biotek.com/resources/articles/micro-volume-purity-assessment-nucleid-acids.html > http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?ID=C108952&Mask=480#UV-Vis-Spec > > 最初のリンクにはいろいろ情報が載ってます。グアニジンは260 nm付近ですね。 > RNeasyはphenolは使用しないはず。

お返事有難うございます。 削除/引用 No.4761-11 - 2016/01/22 (金) 11:52:27 - S 有難うございます。260に小さなピークが出た後、270に大きなピークが出て山が二つ出ています。 そして270の方の山が大きいのです。 >[Re:5] rrrさんは書きました : > RNAの吸収スペクトルって250-270あたりまで幅広く見えるけど、ピークが2本あるとかでしょうか？ > フェノールのコンタミで出るピークはどちらかというと220-230 nm付近だと思うのだけど。

お返事有難うございます。 削除/引用 No.4761-10 - 2016/01/22 (金) 11:49:20 - S 有難うございます。 キットのライセートがQIAzolというのですが、恐らく成分にフェノールが入っています。 プロトコール中にはクロロホルムとエタ沈の過程も入っていますのですが、うまく除けていないようです。 >[Re:4] おおさんは書きました : > わたしもpHがまずきになります。フェノールなら、クロロフォルムで一度処理してエタ沈すれば除けます。そのキットフェノールがはいってるんですかねぇ。。。

お返事有難うございます。 削除/引用 No.4761-9 - 2016/01/22 (金) 11:46:27 - S 丁寧に有難うございます。 溶媒は現在はRNAseFreewaterを用いています。 一度弱塩基性の水で行ってみます。 供給元にも問い合わせてみます。 >[Re:3] APさんは書きました : > 普段、波長スキャンでは見ないので、それが一般的な現象かどうかわかりませんが、 > > まずは、キットの供給元に問い合わせるのが一番だと思います。あとnanodropの供給元にも。情報は一番集まってくるところなので、それが典型的な現象なのか特殊なのか、対処法はあるかなどなど、 > > ひとつ思いついたのは、RNAの溶媒が純水だとピークが若干、ブロードになったり、Ratioが低めに出たりするんですよね。弱塩基性のバッファー中でないと正確な吸光度は測れない。 > http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9067025 > > nanodropだとRNAサンプルを直接アプライして測定しているかもしれないけれど、純水にとかしている場合は、測定用サンプルはバッファーで希釈したものを使ったほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4761-8 - 2016/01/22 (金) 11:13:42 - seventh Lipidのキットはフェノクロの上層をカラム精製に使うようですよ。 通常のフェノクロでもフェノール由来のピークが出ることはまずないと思いますが。 270nm付近の吸光というのが明確なピークなのか260nmのピークがブロードになっているのかでまず何を疑うかも変わって来くると思います。

(無題) 削除/引用 No.4761-7 - 2016/01/22 (金) 10:48:48 - AP phenolは210付近と270付近にピークがあるようですね。 http://www.biotek.com/resources/articles/micro-volume-purity-assessment-nucleid-acids.html http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?ID=C108952&Mask=480#UV-Vis-Spec 最初のリンクにはいろいろ情報が載ってます。グアニジンは260 nm付近ですね。 RNeasyはphenolは使用しないはず。

(無題) 削除/引用 No.4761-6 - 2016/01/22 (金) 10:34:01 - おお >[Re:5] rrrさんは書きました : > RNAの吸収スペクトルって250-270あたりまで幅広く見えるけど、ピークが2本あるとかでしょうか？ > フェノールのコンタミで出るピークはどちらかというと220-230 nm付近だと思うのだけど。 http://www.nanodrop.com/Library/T042-NanoDrop-Spectrophotometers-Nucleic-Acid-Purity-Ratios.pdf phenolは270nmあたりに吸収極大がありますけどね。

(無題) 削除/引用 No.4761-5 - 2016/01/22 (金) 10:16:25 - rrr RNAの吸収スペクトルって250-270あたりまで幅広く見えるけど、ピークが2本あるとかでしょうか？ フェノールのコンタミで出るピークはどちらかというと220-230 nm付近だと思うのだけど。

(無題) 削除/引用 No.4761-4 - 2016/01/22 (金) 03:45:14 - おお わたしもpHがまずきになります。フェノールなら、クロロフォルムで一度処理してエタ沈すれば除けます。そのキットフェノールがはいってるんですかねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.4761-3 - 2016/01/21 (木) 19:44:10 - AP 普段、波長スキャンでは見ないので、それが一般的な現象かどうかわかりませんが、 まずは、キットの供給元に問い合わせるのが一番だと思います。あとnanodropの供給元にも。情報は一番集まってくるところなので、それが典型的な現象なのか特殊なのか、対処法はあるかなどなど、 ひとつ思いついたのは、RNAの溶媒が純水だとピークが若干、ブロードになったり、Ratioが低めに出たりするんですよね。弱塩基性のバッファー中でないと正確な吸光度は測れない。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9067025 nanodropだとRNAサンプルを直接アプライして測定しているかもしれないけれど、純水にとかしている場合は、測定用サンプルはバッファーで希釈したものを使ったほうがいいでしょう。

RNeasy Lipid Tissue Mini Kitのコンタミ 削除/引用 No.4761-1 - 2016/01/21 (木) 16:18:26 - S いつも勉強させて頂いております。 有り難うございます。 私はRNeasy Lipid Tissue Mini Kitを用いてマウスの脊髄のmRNAの精製を行っております。精製終了後に吸光度計(Nano Drop)で確認すると、いつも270の位置でコンタミが生じ、フェノール等のコンタミが疑われています。 プロトコールやトラブルシューティングを見直して何度もやり直しましたが、なかなかうまく行きません。 以前、キットを使わずにTrisol法で行っていた時からこのフェノールのコンタミは取り除くことが出来ませんでした。 波形で見ると、260のmRNAのピークが270のコンタミに引っ張られて、いびつな波形になってしまっています。 改善に向けて、皆様ご意見を頂けませんでしょうか。

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