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デルタデルタCT法でのthresholdの設定 トピック削除
No.4838-TOPIC - 2016/02/12 (金) 07:26:48 - にこる
よろしくお願いいたします。
質問内容の要旨は、異なるプレート間で遺伝子発現をデルタデルタCT法で比較したい場合、同一プレート内の異なるtarget遺伝子、または異なるプレート間でthresholdの設定値は同じに設定するべきでしょうか。
現在realtime RT-PCRを用いてマウスから採取したサンプル間でサイトカイン発現の比較をしています。デルタデルタCT法にて相対比較をしており、内在性コントロールとしてGAPDHを用いています。
target遺伝子はGAPDHを含めて8種類使用しており、duplicateにしても1プレートに6サンプルずつしか計測できない状態です。
使用している機器はAplied BiosystemsのStep One Plusで、現在使用している設定ではCT値を決定するthresholdの設定はautoにしています。
この設定で計測を行うと、同一プレート内の8種類の異なった遺伝子ごとに異なったthresholdの値が設定され、それに基づいてCT値が決定されます。
また、異なるプレート間でのthresholdの設定を見てみると、同じ遺伝子でもプレートごとにthresholdの値が異なっていました。
この異なるthresholdに基づいて決定されたCT値を用いてデルタデルタCT法の2^-ddCTの計算を行うのは間違っているように思うのですが、同じラボの人に聞いたところそのまま計算するもんだと言われました。
thresholdの設定値は少なくとも同一プレート内では異なった遺伝子でも同じに設定するべきと思うのですが、いかがでしょうか。
皆様宜しくお願い申し上げます。
 
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(無題) 削除/引用
No.4838-10 - 2016/02/15 (月) 10:05:49 - seventh
まとめて同じ設定にするということはプレート毎の違いを無視するということなので問題が生じる可能性はあります。蛍光色素の劣化などで蛍光強度そのものは同一で行うのはむずかしいと思うので。
一番確実なのは同じサンプル(できれば希釈系列をつくって)を複数回試行してどっちの方法が誤差が少ないか確認することだと思います。

(無題) 削除/引用
No.4838-9 - 2016/02/14 (日) 07:55:23 - にこる
おおさん、コメントありがとうございます。

僕もthresholdを揃えてしまって問題がないかどうかわからないので、まさにこのスレを立てさせていただきました。
もしおおさんが具体的に問題となる点をご指摘いただけるのであれば、よろしくお願いいたします。
ほかに詳しい方がいらっしゃったらご教授いただければありがたいです。

WB re-probing 削除/引用
No.4838-8 - 2016/02/13 (土) 08:47:12 - おお
よくわからないのですがThresholdを揃えちゃって問題が生じないですか?

(無題) 削除/引用
No.4838-7 - 2016/02/13 (土) 06:53:25 - にこる
Colさん、お返事ありがとうございます。
同じような問題が発生したことがあるとのご意見で、すこし安心(?)しました。すべてを同じtargetにするというのは、つまりthresholdの設定をmanualですべて同一に設定するということと考え方は同じですよね。

(無題) 削除/引用
No.4838-6 - 2016/02/13 (土) 04:27:30 - Col
Step Oneに付属するソフトはターゲットを設定するごとに各々にCTを決めてきます。昔々のApplied bioのものは違ってましたが。

似たような問題を抱えたことがあったので、私はターゲットが8種類だとしても1種類としてセットアップ画面を処理しています(Target1のみ)。

あとで、エクセル表に戻ってターゲット遺伝子名を入れる。

(無題) 削除/引用
No.4838-5 - 2016/02/12 (金) 13:47:36 - おお
Thresholdの問題ではなくって比較をいかにしてやるかの問題で、一つでも共通のもので基準があればプレート間の比較ができるでしょう。もちろんスタンダードなりをとって直線性があるようにThresholdを設定したうえで。

あと発音確認されたほうがいいかも。よんでて一瞬綴がわからんくなってしまった。
http://ejje.weblio.jp/content/Threshold

(無題) 削除/引用
No.4838-4 - 2016/02/12 (金) 13:21:35 - にこる
seventhさん、お返事ありがとうございます。

> 原理的なことを言えば対象の遺伝子のmRNA量とCtがリニアに相関するようなスレッシュホルドを設定すれば良いので遺伝子毎にスレッシュホルドが違っても問題ありません。

同一プレート内でのサンプル間比較については、おっしゃるように遺伝子ごとにシュレッシュホルドが違っていても比較可能と理解しているつもりなのですが、プレートの異なるサンプル同士を比較しようとした場合、それぞれの遺伝子ごとのスレッシュホルドが違ってしまうとデルタCT(CTtarget-CTgapdh)の値が変わってきてしまうことを心配しています。
現状では、機器の自動設定されているスレッシュホルドは、同一プレート内でも遺伝子ごとに異なっており、さらに異なるプレート間の同一遺伝子のスレッシュホルドも異なっているため、ちょっと自分自身も混乱しています。

> 質問内容とは異なりますが、ターゲットを2つに分けてGAPDHを両方のプレートで測れば良いのでは?

説明が不十分ですみません。
現在様々な感染条件下でマウスからのサンプリングをしているため、サンプル総数は50を超えています。そのため、プレート間比較は避けられないような状況なんです。


おおさんもお返事ありがとうございます。
> 何かスタンダードになるものを両方のプレートにのせておけばいいだけの話だと思いますが、、、

確かにおっしゃることはその通りなのですが、そのスタンダードになる遺伝子の設定も、スレッシュホルドの値でCT値が変化してしまうと思います。
質問をもう一度整理しますと、

1.デルタデルタCT法で相対比較を行う場合、同一プレート内の複数の遺伝子で同一のスレッシュホルドを設定する必要があるか?

2.同様の条件で複数枚のプレートで解析を行う場合、異なるプレート間における同一遺伝子のスレッシュホルドは同一にする必要があるか?

以上の2点をお聞きできればと思いご質問させていただきました。
説明があまりうまくできずすみません。
1.に関してはseventhさんのお答えにもあるように、必ずしも同一のスレッシュホルドでなくても解析可能(同一のスレッシュホルドに設定することも特に問題はない)と解釈させていただきました。
現在、1.2.を同時に満たしたいような実験を行っているため、最もリーズナブルな方法としては、すべてのスレッシュホルドを一定値に固定してしまうというのがいいのかなと考えている次第です。

またご意見などいただけましたら大変ありがたいです。

(無題) 削除/引用
No.4838-3 - 2016/02/12 (金) 11:34:44 - おお
何かスタンダードになるものを両方のプレートにのせておけばいいだけの話だと思いますが、、、

(無題) 削除/引用
No.4838-2 - 2016/02/12 (金) 10:34:43 - seventh
原理的なことを言えば対象の遺伝子のmRNA量とCtがリニアに相関するようなスレッシュホルドを設定すれば良いので遺伝子毎にスレッシュホルドが違っても問題ありません。

質問内容とは異なりますが、ターゲットを2つに分けてGAPDHを両方のプレートで測れば良いのでは?ターゲットとリファレンスは同じプレートに置く、同じ遺伝子は同じプレートで測定するとすれば少なくともプレートによる誤差は考慮しなくても良くなりますし。

デルタデルタCT法でのthresholdの設定 削除/引用
No.4838-1 - 2016/02/12 (金) 07:26:48 - にこる
よろしくお願いいたします。
質問内容の要旨は、異なるプレート間で遺伝子発現をデルタデルタCT法で比較したい場合、同一プレート内の異なるtarget遺伝子、または異なるプレート間でthresholdの設定値は同じに設定するべきでしょうか。
現在realtime RT-PCRを用いてマウスから採取したサンプル間でサイトカイン発現の比較をしています。デルタデルタCT法にて相対比較をしており、内在性コントロールとしてGAPDHを用いています。
target遺伝子はGAPDHを含めて8種類使用しており、duplicateにしても1プレートに6サンプルずつしか計測できない状態です。
使用している機器はAplied BiosystemsのStep One Plusで、現在使用している設定ではCT値を決定するthresholdの設定はautoにしています。
この設定で計測を行うと、同一プレート内の8種類の異なった遺伝子ごとに異なったthresholdの値が設定され、それに基づいてCT値が決定されます。
また、異なるプレート間でのthresholdの設定を見てみると、同じ遺伝子でもプレートごとにthresholdの値が異なっていました。
この異なるthresholdに基づいて決定されたCT値を用いてデルタデルタCT法の2^-ddCTの計算を行うのは間違っているように思うのですが、同じラボの人に聞いたところそのまま計算するもんだと言われました。
thresholdの設定値は少なくとも同一プレート内では異なった遺伝子でも同じに設定するべきと思うのですが、いかがでしょうか。
皆様宜しくお願い申し上げます。

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