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一塩基変異を持つヘテロ接合体のPCR（DGGE?c トピック削除
No.5934-TOPIC - 2017/04/24 (月) 00:26:48 - PCR
お世話になります。

ある遺伝子のエクソン内に一塩基変異を持つヘテロ接合体の細胞を解析しています。
この変異を中心になるよう設計したプライマーでDNAから増幅したPCRプロダクトを電気泳動すると、二つのバンドが認められました。約50塩基ほどの違いです。（300と350bp）

当初、同じサイズのPCRプロダクトができると思っていましたので、驚きましたが、Hetero duplexも可能性もありそうですね。ただ、一塩基の違いだけでこのような大きなバンド差をうむのでしょうか？

ちなみにPCRプロダクトをダイレクトシークエンスしたり、プラスミドにクローニングしたりして、一塩基の違いだけだということは確認しています。

ご年配の先生にご相談したところ、DNAシークエンサーが今ほどパワフルではなかった時代、変異を検出する方法としてDGGかDDGという電気泳動法があって、、というおぼろげなお話をしていただきました。

調べたところ、Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE）というのがヒットして、それらしいことが書かれてありました。ただ、今回私は変性剤を電気泳動には使っておらず、ただの1.5％ Agarose in TAEで調製したゲルのみです。

なぜ二つのバンドができてしまうのか、わかりませんがヘテロデゥープレックスであることは間違いなさそうですね。何かコメントをいただけるようでしたら、宜しくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.5934-5 - 2017/04/24 (月) 17:13:25 - AP
Heteroduplexで間違いないでしょう。
一塩基程度のミスマッチのヘテロ二重鎖を非変性ゲルで流したときでも、移動度がおかしいくなることはあります。いつも必ずというわけでもなさそうなので、鎖長やミスマッチの位置取りなどなどで移動度が変わりやすいものとそうでないものはありそうです。

http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=5418

(無題) 削除/引用
No.5934-4 - 2017/04/24 (月) 04:00:15 - おお
どうしてもというなら完全な変性状態で電気泳動してサイズは変わらないということを示せばスッキリはするけど、シーケンスの結果明らかであればそれはそこまでする必要がないかもしれません。

例えばヘテロでない完全な２本鎖のDNAを両方用意して、同量を混ぜてから変性して再アニーリングして流してみてもいいかもしれませんけど、不完全なアニーリングのDNAが交じると更にバンドが増えてしまう可能性もあるかもしれませんので、決定的なことが言えるかはやってみないと、、、

(無題) 削除/引用
No.5934-3 - 2017/04/24 (月) 03:18:10 - PCR
おおさま、ありがとうございます。
一塩基ミスマッチの影響はかなり大きいということですね。

野生型のPCRプロダクトが以下で、
5'- GCATGCATGCATGCAT.........GCATGCATGCATGCAT -3'
3'- CGTACGTACGTACGTA.........CGTACGTACGTACGTA -5'

Hetero duplexをとるプロダクトが以下ですが、
5'- GCATGCATGCATGaAT.........GCATGCATGCATGCAT -3'
3'- CGTACGTACGTACGTA.........CGTACGTACGTACGTA -5'

C to a mutationだけなのですが、この一塩基ミスマッチで移動度が変わってしまうのですね。
論文に示す際にはこのような記述でもいいのでしょうか？それともHetero duplexをとったとしても野生型のサイズと同じになるプライマーセットを作り直すべきでしょうか。

一塩基ミスマッチ特異的制限酵素で大きい方のバンドが消化できるかを併せて示せばいいのでしょうか。
質問に質問を重ねて大変失礼ですが、どうかまたコメントをいただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用
No.5934-2 - 2017/04/24 (月) 01:52:29 - おお
高次構造の違いなどにより移動度が変わったりします。

一塩基変異を持つヘテロ接合体のPCR（DGGE?c 削除/引用
No.5934-1 - 2017/04/24 (月) 00:26:48 - PCR
お世話になります。

ある遺伝子のエクソン内に一塩基変異を持つヘテロ接合体の細胞を解析しています。
この変異を中心になるよう設計したプライマーでDNAから増幅したPCRプロダクトを電気泳動すると、二つのバンドが認められました。約50塩基ほどの違いです。（300と350bp）

当初、同じサイズのPCRプロダクトができると思っていましたので、驚きましたが、Hetero duplexも可能性もありそうですね。ただ、一塩基の違いだけでこのような大きなバンド差をうむのでしょうか？

ちなみにPCRプロダクトをダイレクトシークエンスしたり、プラスミドにクローニングしたりして、一塩基の違いだけだということは確認しています。

ご年配の先生にご相談したところ、DNAシークエンサーが今ほどパワフルではなかった時代、変異を検出する方法としてDGGかDDGという電気泳動法があって、、というおぼろげなお話をしていただきました。

調べたところ、Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE）というのがヒットして、それらしいことが書かれてありました。ただ、今回私は変性剤を電気泳動には使っておらず、ただの1.5％ Agarose in TAEで調製したゲルのみです。

なぜ二つのバンドができてしまうのか、わかりませんがヘテロデゥープレックスであることは間違いなさそうですね。何かコメントをいただけるようでしたら、宜しくお願いいたします。
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