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(無題) 削除/引用 No.6055-13 - 2017/06/20 (火) 19:55:41 - MP もしダメならin fusionというのは選択肢としてありだと思います。個人的にはGibsonのほうが好きですが。話はずれますが、 SLiCE 法 はどの程度使えるものなのでしょうか？本格的に導入を検討中なのですが、実際に使われている方いらっしゃいますか？

(無題) 削除/引用 No.6055-12 - 2017/06/20 (火) 08:29:14 - doura ligaseいれているとか。 毒性があるとき、逆向きに入ることが多いのですがどうでしょう

(無題) 削除/引用 No.6055-11 - 2017/06/19 (月) 15:48:37 - mon >[Re:9] 774Rさんは書きました : > pENTR D-TOPOはよく使いますけど、出てくるコロニーはほとんど当たりです。 私も多用していますが、なぜかどうしても入らない1.2kbほどのcDNAが１つあります。これは諦めてDEST vectorに制限酵素でクローン化しました。

(無題) 削除/引用 No.6055-10 - 2017/06/19 (月) 14:26:21 - おお >プラスミド抽出後のPCRでインサートの挿入を確認した結果 せっかく精製したんだから制限酵素度一度確認するべきでは？PCRってこの手の実験では１００％信用していないので。

(無題) 削除/引用 No.6055-9 - 2017/06/19 (月) 14:09:30 - 774R pENTR D-TOPOはよく使いますけど、出てくるコロニーはほとんど当たりです。 反応時間も、たの実験の都合で午前中に反応開始して夕方まで室温で放置していても問題になったことはありません。 そこまで空ベクターを拾うということは、製品の不良を疑うべきかもしれませんね。 ほかのインサートや製品に添付されてるコントロール用インサートで実験して確認を取るべきだと思います。 また、あるていどのバックグラウンドは出る可能性はあります。 通常は当たりコロニーが大多数なので問題にならないわけですが、たとえば正しくインサートが挿入されたプラスミドが大腸菌の生育を阻害してる場合、出てくるコロニーはすべて空ベクターということになります。 やはり他のインサートやコントロールのインサートで確認すべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.6055-8 - 2017/06/19 (月) 12:23:39 - 冬待ち > マニュアル確認したら反応は30minまでOKのようでした。 > 皆さんおしゃられているように、反応は５分でやるべきです。 > クラッシックなLigaseを使った方法じゃなくTopoisomeraseを使っているので何か２次的な酵素反応が起きているのでは？マニュアルのプロトコールは５分になってますし。 ご回答ありがとうございます。 やはりライゲーション時間の長さが疑わしいということのようですね。反応時間30分で再挑戦しようかと思います。キットの解説では30秒−30分となっていましたが、長い場合の例が>1kbであり、また反応時間が長すぎた場合の問題などは書かれていなかったので、推奨よりもかなり長い条件で行っていました。むしろ30分でできなかった場合にこうするべきでした。 しかし、室温の反応条件で1.5時間程度超過するだけでインサートの入っていないコロニーを作るような産物が生まれるというのは驚きました。反応を失活させる方法などは表記されていないようなので、うまくいった場合でも反応産物を保存しておいてまた使うのはやめておいた方がよさそうですね。 > ただpENTR-D-TOPOでのクローニングはものによっては結構苦労した記憶があります。7kb以上となると結構厳しい気がします。制限酵素でpENTR 2 (今は別の名前になっている？）にいれるか、BP反応を利用したほうが早いかもしれません。 代替案のご提示ありがとうございます。この系でうまくいかなければin-fusion法を試す予定でした。30分の反応でうまくいかなかった場合に参考にさせていただきたいのですが、挙げていただいた二つと併せて比較してどれが適しているなどありますでしょうか。それぞれの利点や欠点など自分で勉強して決めようとは思うのですが、この方法でうまくいった、などの実体験、あるいは別の候補などももしあれば教えていただけると幸いです。目的の挿入断片は 7−9kbで、エントリーベクターへのクローニングののち植物用のバイナリベクターにクローニングする予定です。

(無題) 削除/引用 No.6055-7 - 2017/06/17 (土) 09:55:58 - MP マニュアル確認したら反応は30minまでOKのようでした。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.6055-6 - 2017/06/17 (土) 09:43:52 - MP 皆さんおしゃられているように、反応は５分でやるべきです。ただpENTR-D-TOPOでのクローニングはものによっては結構苦労した記憶があります。7kb以上となると結構厳しい気がします。制限酵素でpENTR 2 (今は別の名前になっている？）にいれるか、BP反応を利用したほうが早いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6055-5 - 2017/06/16 (金) 20:48:59 - mon ＞pENTR D-TOPOにはccdB遺伝子はないと思われ。。。 そうでしたか。pCR4-TOPOにはありますので、勘違いですね。。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.6055-4 - 2017/06/16 (金) 18:33:38 - 774R >pENTRのccdB pENTR D-TOPOにはccdB遺伝子はないと思われ。。。 destination vectorと勘違いしてませんか？

(無題) 削除/引用 No.6055-3 - 2017/06/16 (金) 14:00:56 - mon おおさんが指摘していますが、反応時間が長すぎることが原因の他に、 XL10-gold株はF'因子を持っている＝解毒遺伝子ccdA遺伝子を有するため、pENTRのccdB自殺遺伝子(F由来）に多少？耐性である可能性があります。ただしplasmidコピー数が違う(F'＝1コピー/cell、pENTR>100コピー）ので問題ないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6055-2 - 2017/06/16 (金) 13:22:58 - おお >ライゲーションを室温、オーバーナイトで行いました。 >2時間ライゲーション、オーバーナイトライゲーションともにコロニーが生えました。 クラッシックなLigaseを使った方法じゃなくTopoisomeraseを使っているので何か２次的な酵素反応が起きているのでは？マニュアルのプロトコールは５分になってますし。

pENTR/ D- TOPO の空ベクターでコロニーが生えます 削除/引用 No.6055-1 - 2017/06/16 (金) 13:00:09 - 冬待ち はじめまして。現在invitrogenのpENTR/D-TOPOのキットを用いてクローニングを行っています。その中で、インサートの入っていないコロニーが多数生えてしまったので質問させてください。 まず、目的のインサートDNAが7-9kbと比較的長いので、ライゲーションを室温、オーバーナイトで行いました。続いて研究室で自作しているXL10-goldコンピテントセルにヒートショックで形質転換し、カナマイシン添加培地にて選抜を行いました。生えてきたコロニーに対して、コロニーPCR、プラスミド抽出後のPCRでインサートの挿入を確認した結果、いずれのコロニーでもインサートの挿入が確認できませんでした。 そこで、インサートDNAの代わりに滅菌水を添加して同様の処理を行ったところ、インサート有りのものと同数程度（>100コロニー/プレート）のコロニーが生えました。次に実験過程でのDNA小断片のコンタミを疑い、使用する器具や滅菌水、実験台などを洗浄、オートクレーブなどして可能な限り清潔にし、インサートなしでの処理を行ったところ、2時間ライゲーション、オーバーナイトライゲーションともにコロニーが生えました。 自作のコンピテントセルに対してプラスミドベクター、インサートDNAを入れずに同様の処理をしてもコロニーは生えなかったので、選抜培地、コンピテントセルには問題はないかと思われます。また、キットは最初のライゲーション時点で未開封でした。 原因、問題点、改善策、代替案などありましたらお知恵をお貸しいただけると幸いです。

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